叶黄素（Lutein）是人眼部视网膜黄斑部的主要色素。叶黄素对视网膜中的黄斑有重要的保护作用，是帮助眼睛健康发育的关键营养元素，人体无法通过自身合成，必须靠摄入叶黄素来补充。若眼睛缺乏叶黄素，会引起黄斑退化和视力模糊，甚至出现视力退化、近视、视网膜病变等症状，严重的可导致失明。

目前，金盏花是商业叶黄素生产的主要来源。然而，种植成本高、生长环境苛刻等因素在本质上限制了天然叶黄素的进一步开发利用。相比之下，微藻（microalgae）具有生长快、叶黄素含量高、培养环境要求简单等特点，被认为是天然叶黄素最理想的来源。

小球藻(Chlorella sorokiniana)因其优异的生产效率和对不同营养模式和广泛培养条件的适应性而成为一种有商业前景的叶黄素生物合成菌株。

近期，福州大学生物科学与工程学院副研究员谢友坪老师在影响因子为11.4的《Bioresource Technology》杂志中发表了最新的研究成果“High-cell-density heterotrophic cultivation of microalga Chlorella sorokiniana FZU60 for achieving ultra-high lutein production efficiency”。在此研究中，研究人员采用异养培养的方法实现了小球藻FZU60高效生产叶黄素，最后在5L生物反应器（迪必尔生物）上做了放大培养。

结果显示，通过在补料阶段优化营养物组分和浓度的方法，叶黄素的产量和生产速率最高达到了415.93 mg/L和82.50 mg/L/d。本研究提出了一种在藻类细胞中通过补料批次培养策略进行异养培养的方式，可以显著提高叶黄素的生产性能，具有很大的工业应用潜力。

如图1a所示，小球藻 FZU60在0-24 h期间处于适应阶段，生物量生产速率较低。在24-58 h进入对数生长期，藻类生物量浓度(5.04 g/L)和生产力(2.04 g/L/d)在58 h达到峰值。在58 h之后，生物量浓度和生产速率均有下降，这可能是由于此时碳、氮源枯竭（图1c），影响了细胞的C/N代谢，阻碍了藻类细胞的生长。

如图1b所示，叶黄素含量随着孵育时间的延长而增加，在120 h时达到最高水平(4.09 mg/g)。当培养基中碳源和氮源几乎耗尽，叶黄素仍然在持续合成，可以推断，叶黄素的合成不需要培养液中可用的氮源和碳源。

如图2所示，随着ICC的增加，小球藻FZU60的生物量生产速率先升高后降低，在ICC为1.40 g/L时达到最大值2.42 g/L/d，叶黄素含量从3.90 mg/g逐渐增加到4.79 mg/g，叶黄素最大生产速率达到最高，为10.71 mg/L/d。说明在一定范围内增加ICC有利于提高藻类细胞的异养生长速率和叶黄素的生成。因此，确定异养生产叶黄素的最佳ICC为1.40 g/ L。

从图3可以看出，小球藻 FZU60的生物量生产速率、叶黄素的含量及叶黄素生产速率在培养温度从20℃升高到30℃后显著增加，在30℃时，小球藻的生物量、叶黄素含量和生产速率达到最高，然后随着温度进一步升高到40℃均有下降，说明小球藻FZU60异养生长的最佳培养温度为30℃。

为了进一步提高小球藻 FZU60异养培养性能，研究了3种基于营养成分组成的补料批次策略(补料批次GN：浓缩葡萄糖(500 g/L)和硝酸盐(175 g/L)；补料批次MN：浓缩培养基以硝酸盐为氮源；补料批次MU：浓缩培养基以尿素为氮源)。如图4a所示，补料批次GN、MN和MU的最大生物量浓度分别为16.07、54.71和98.40 g/L。补料批次MU的生物量浓度显著高于补料批次GN和MN。补料批次MU的生物量生产速率达到17.96 g/L/d，分别比补料批次GN和MN高231.98%和59.36%(表1)。

如图4a所示，补料批次MN和MU的叶黄素含量从24 h到96 h逐渐增加，96 h后变化不大，而补料批次GN的叶黄素含量在24-72 h时约为2.30 mg/g，随后急剧下降。最值得注意的是，补料批次MN的叶黄素含量始终超过补料批次GN和MU，且顺序为补料MN >补料MU >补料GN。

然而，由于生物量浓度和生产力较高，补料批次MU的叶黄素产量和生产力分别达到289.20 mg/L和56.93 mg/L/d，高于补料批次GN和MN(表1)。综上所述，补料批次MU是一种非常有效的提高小球藻FZU60异养生长性能的补料策略。

基于营养成分不同的补料策略研究结果表明，与补料GN和MN相比，补料MU的叶黄素产量和生产力更高。接下来以尿素为氮源，研究了三种不同营养浓度的培养基补料策略(补料批次1F：浓缩1倍；补料批次3F：浓缩3倍；补料批次6F：浓缩6倍)。

如图5所示，补料批次3F的最高生物量浓度在144 h达到186.86 g/L，分别比补料批次1F和6F提高了102.76%和44.83%，且顺序为补料3F >补料6>补料1F。在整个培养过程中，补料批次1F的叶黄素含量从1.67 mg/g逐渐增加到4.09 mg/g。高于补料批次3F和6F策略的叶黄素含量，表明低浓度的营养成分有利于叶黄素在藻类细胞中的积累。这可能是由于底物的周期性和频繁限制引起的应力效应。然而，补料批次3F获得了极高的生物量浓度（161.82 g/L）、生物量生产速率（32.10 g/L/d）、叶黄素产量(415.93 mg/L)和叶黄素生产速率(82.50 mg/L/d) (表2)，分别比1F/6F饲料批次高51.88%、63.17%、52.98%和63.79%。

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案例分享丨小球藻在T&J-Lux A搅拌式光照生物反应器上的培养应用

文中提到的反应器是来自迪必尔生物的Intelli-Ferm A/B/Q 系列台式发酵罐（图6、图7）。

该反应器罐体（玻璃、一次性）体积覆盖3L-15L，不仅满足细菌、真菌的高密度培养，还可进行小球藻（Chlorella soroiniana）、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、雨生红球藻(Haematococcus Pluvialis)等微藻类植物细胞的高密度培养（图6c）。

此外，为了满足微藻类植物细胞的光自养、异养和混养三种模式，迪必尔生物对该系列生物反应器进行升级，开发出了T&J-Lux A搅拌式光照生物反应器（图7）。

反应器内置红、蓝、绿三种不同颜色的光源，可实现最高50000Lux的光照强度。与硬件匹配的软件系统整合了光亮等级分步设计，可进行光亮参数梯度调节，同时可进行光暗比的循环控制，满足不同微藻类植物细胞对光色类别、光色比例、光照强度和光暗周期等工艺参数的调整。