微生物发酵是一种利用微生物的生长和代谢活动来生产所需产品的技术。在微生物发酵过程中，我们通常会对一些工艺参数，如pH、温度、溶氧、搅拌速度等进行在线检测和控制。然而，判断菌种生长状况的生化指标如代谢产物、营养物质浓度等需要采用传统的离线取样方法。这种方法需要较长的取样周期和复杂的实验室操作，可能带来潜在的污染风险。

原位拉曼光谱技术作为一种有效的过程分析工具（PAT），能够实时监控发酵过程中的关键参数，如营养成分、代谢产物、最终产品和细胞增长。这种过程监测技术提供的数据有助于优化发酵工艺，实现质量源于设计（QbD）的目标，从而确保产品高品质。

迪必尔生物CloudReady™云平台平行生物反应器采用了先进的D²MS数据和设备管理系统，支持OPC和Snap7协议，实现了与市场上绝大多数的PAT设备的无缝对接，进而监控更为广泛的关键过程参数。本次案例使用CloudReady™云平台平行生物反应器整合ReactRaman™ 802原位拉曼光谱仪，完成大肠杆菌发酵过程中生化指标的在线监测与反馈控制。

在1.5L的CloudReady™云平台平行生物反应器中进行大肠杆菌的发酵培养，培养条件如表1所示。在整个培养周期中，每隔2h进行离线取样测量OD、碳源浓度（甘油）。同时，使用ReactRaman™ 原位拉曼光谱仪的探头收集离线样品的光谱，并上传测量结果至配套的iC Raman分析软件。软件将各时间点的光谱与测量值一一对应，并建立预测模型。将探头插入反应器中，作为在线PAT工具实时跟踪OD和甘油浓度。

甘油作为大肠杆菌碳源，其浓度会直接影响细胞的生长速率和代谢过程。由于渗透压应激和代谢应激的存在，过高的甘油浓度可能会对大肠杆菌产生抑制作用。因此，测量甘油浓度并确保其处于适宜的低水平范围对于维持细胞生长和代谢活性是必要的。实验结果显示甘油的离线数据与原位拉曼光谱仪的在线值之间的一致性(RMSE = 0.741g/L)。下图表明，原位拉曼光谱仪作为在线PAT工具准确地反映了生物反应器内的微生物培养条件。

OD（光密度）测量是估计培养物中细胞浓度的一种快速且简便的方法。OD值与培养物中的细胞数量呈正相关，通过定期测量OD值，可以绘制出大肠杆菌的生长曲线。实验结果显示OD的离线数据与原位拉曼光谱仪的在线PAT值之间的一致性(RMSE = 4.926)

如图5所示，拉曼光谱技术能够实现对多个关键技术指标的在线监控。这一过程涉及将拉曼光谱数据实时传输至生物反应器，并与DCS等控制系统相结合。通过这种方式，可以利用控制系统的补料流加等模块，对特定参数进行在线反馈控制。如图5、图6所示，D²MS上位机软件与拉曼光谱仪支持使用OPC UA 协议将数据实时发送至控制系统。

在本次反馈控制策略中，使用原位拉曼光谱仪测量，CloudReady™每5分钟获取一次OD平均值。然后，将当前时间段内的平均OD值和前一个时间段的平均OD值代入上述公式连续计算每个5分钟时间段的比生长速率。这些比生长速率随后被划分为低（0.00167至0.005）、中（0.005至0.01）和高（0.01至0.01667）三个不同区间，并据此进行分段反馈补料。不同区间的补料速率会根据各自的补料步长和峰值限制进行调整。此外，实时监控甘油浓度，并将其与预设的阈值（1g/L）进行比较，以此协同控制补料速率。补料速率的调整如图7。

本次实验表明了利用强大的D²MS数据和设备管理系统将CloudReady™云平台平行生物反应器与原位拉曼光谱仪进行协同作用，实现多个关键分析物的实时监测并执行反馈控制。生物反应器加上PAT工具可以通过实时在线的连续数据来加速对工艺过程的理解，可以进一步提升发酵过程工艺水平和自动化程度，并最终实现基于QbD（质量源于设计）的产品开发。

迪必尔生物 应用技术与工程研究中心（CARE）柴金言 许志国 供稿