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罗伊氏乳杆菌氮源利用的选择性与特征分析
来源:江南大学 食品学院,江苏 无锡,214122 | 作者:迪必尔生物 | 发布时间: 2018-11-01 | 530 次浏览 | 分享到:
罗伊氏乳杆菌是人体重要的益生菌,氮源是制约其发酵生产的关键因素,研究其有效利用的氮源种类和特征将 进一步指导该菌的发酵培养。通过分批培养系统分析了罗伊氏乳杆菌 138-1 对 21 种市售氮源的利用效率,并通过恒 pH自动反馈补糖工艺,结合高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)测定了各氮源被罗伊氏 乳杆菌 138-1 利用前后氨基酸和肽的变化,分析了该菌株对氮源种类和肽分子量的利用规律。


    

江南大学 食品学院,江苏 无锡,214122


罗伊氏乳杆菌氮源利用的选择性与特征分析

 迪必尔生物MiniPod微生物平行培养系统的经典应用



 摘要 

    罗伊氏乳杆菌是人体重要的益生菌,氮源是制约其发酵生产的关键因素,研究其有效利用的氮源种类和特征将 进一步指导该菌的发酵培养。通过分批培养系统分析了罗伊氏乳杆菌 138-1 对 21 种市售氮源的利用效率,并通过恒 pH自动反馈补糖工艺,结合高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)测定了各氮源被罗伊氏 乳杆菌 138-1 利用前后氨基酸和肽的变化,分析了该菌株对氮源种类和肽分子量的利用规律。结果表明,罗伊氏乳杆 菌 138-1主要利用氮源中低于1000 Da的小分子肽,且对500 Da以下的小分子肽利用率最高。各氮源中均含有丰富的 小分子肽,但该菌株氮利用具有底物特异性,能更有效地利用酵母提取物、酵母蛋白 103、酵母浸粉 528 及酵母浸粉 803等酵母类蛋白胨中的小分子肽,对酵母类氮源的利用效率显著高于植物、乳品和动物组织类氮源。



 
关键字 

罗伊氏乳杆菌;氮源;高效液相(high performance liquid chromatography,HPLC);肽  DOI: 10.13995/j.cnki.11-1802/ts.017734 


 

罗伊氏乳杆菌属于乳酸杆菌,革兰氏阳性菌,无芽孢,不运动,方形杆状,属于专性异型发酵,生长过程中会产生 CO2、乳酸、乙酸和乙醇等。罗伊氏乳杆菌是目前报道的可存在于所有脊椎动物和 哺乳动物肠道内的乳酸杆菌,在厌氧或非厌氧环境中都可以生长[1-2]。 

罗伊氏乳杆菌作为乳酸菌的一种,是多氨基酸营养缺陷菌株,不能直接利用外源蛋白质和无机氮 源,必须通过降解外源蛋白质或肽,以保证菌体正常生长代谢对氨基酸的需要。通常乳酸菌均编码相 对完善的蛋白水解系统,主要由三部分组成[3]:细胞壁表面的蛋白水解酶;不同类型的氨基酸、二 肽、三肽和寡肽转运系统;以及一些胞内肽酶。首先由细胞壁蛋白水解酶降解外源蛋白形成寡肽和氨 基酸,目前大多数研究的都是乳酸菌在乳制品中的蛋白水解体系,乳中的胞外蛋白酶主要水解酪蛋白 [4],其他益生菌株对氮源的利用情况很少涉及。之后通过特定的肽转运和氨基酸转运系统运输到细胞 内,寡肽通过寡肽转运系统 Opp 转运,二肽或三肽则是 DtpP 和 DtpT,多数研究证明寡肽转运系统 Opp 对于菌株利用是重要的[5, 6]。后由胞内各种肽酶将肽降解为更小的肽和游离氨基酸以提供给 菌体生长利用[7]。但是,乳酸菌的蛋白水解系统具有很强的菌株特异性,乳酸菌为适应各自的生长环 境,在进化过程中发生诸如点突变、重组或者重复序列变异等自身基因的变异,及基因水平转移,通 过获得新基因来适应环境[8];亦有一些乳酸菌因生长环境营养丰富,致使一些“无用”的基因不断钝 化、衰退、缺失。

因此,不同环境中的乳酸菌逐渐形成了菌株和环境特异的氮代谢系统,氮源的利用 一直是制约乳酸菌生长的关键因素。罗伊氏乳杆菌 138-1 筛选自长寿老人肠道,通过动物实验被证明 具有降血糖的功效,具有潜在的生产和应用价值。但是,该菌种能够利用什么样的氮源,其对氮利用 具有什么样的特征?目前还是未知。

不同种类的氮源经过不同的水解工艺后,会产生不同组成的氨基酸、寡肽和多肽。罗伊氏乳杆菌 氮代谢系统的底物特异性决定其可能对不同氮源具有不同的利用效率。本文将系统探讨罗伊氏乳杆菌 138-1 对不同种类氮源的利用效率,并进一步分析有效利用的氮源组分,不仅可以为乳酸菌的生产提 供氮源优选策略,而且可以指导氮源生产企业,根据菌株对氮种类和分子量的要求优化水解工艺,让 所生产氮源更适宜菌株的增殖。


1 材料和方法 


1.1 材料与试剂

1.1.1菌株 罗伊氏乳杆菌 138-1(CCFM8631),江南大学食品生物技术中心保藏。

1.1.2试剂 葡萄糖测定试剂盒,上海荣盛生物药业有限公司;MRS 培养基,青岛海博生物技术有限公司; 其余化学试剂均是分析纯,国药集团化学试剂有限公司;市售氮源见表 1。




1.2仪器与设备

GRP-9080 型隔水式恒温培养箱,上海森信实验仪器有限公司;FE20 型 pH 计、EL3002 型电子天 平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;MS 3 basic 型涡旋振荡器,德国 IKA 公司;löserom806m 型冰点渗透压测定仪,德国 löser 公司;T&J-Minipod 1L×8 型迷你平行发酵罐,迪必尔生物 工程(上海)有限公司;MLS-3750 型高温高压灭菌锅,日本 SANYO 公司;ZHJH-C1115B 型超净工 作台,上海智诚分析仪器制造有限公司;UV-2450 紫外分光光度计,日本岛津公司;高效液相色谱仪 Ag1100,美国安捷伦公司。 

1.3试验方法 

1.3.1 菌株的活化与培养 

从冻存的甘油保菌管内,用接种环挑取少量菌液于 MRS 固体培养基划线,将平板置于 37℃恒温 培养箱中培养 24 h。从长出的菌落中挑取单菌落,接种于 5 mLMRS 液体培养基中,在恒温 37℃培养 箱中活化培养 18~24 h。重复上述操作 1 次得到活化后的种子液。

1.3.2 罗伊氏乳杆菌生长曲线的测定 

将上述种子液以 2%的接种量接种到 MRS 液体培养基中,置于恒温 37℃培养箱中培养。每 2 h 取 样,一部分样品测定菌液的 OD600 值,当吸光度值超过 0.8 时,将菌悬液稀释一定倍数,使稀释后的 吸光度值在 0.2~0.8 之间,菌悬液的 OD600 值为测定的吸光度值乘以稀释倍数。然后以时间为横坐 标,OD600 值为纵坐标,绘制菌株生长曲线。另一部分样品离心去除菌体后,测定发酵中的葡萄糖含 量和总酸含量,计算罗伊氏乳杆菌发酵过程中代谢单位葡萄糖的产酸量。

1.3.3 不同氮源发酵液分批培养罗伊氏乳杆菌最高生物量测定 

准确称取 25 g/L 上述不同氮源,替换 MRS 培养基中的所有氮源(胰酪蛋白胨、酵母粉和牛肉 膏),配制成不同氮源的培养基。以 2%的接种量接入待实验菌株,置于温度 37℃培养箱中静置培 养,待菌株生长至稳定期前后(6 h、8 h 和 10 h),取样测定 OD600,以 MRS 为对照。

1.3.4 不同氮源发酵液恒pH自动反馈补糖培养罗伊氏乳杆菌生长曲线测定 



根据 1.3.3 配制不同氮源的培养基,以相同的量置于 T&J-Minipod 1L×8 型迷你平行发酵罐。以 5%的接种量接入待实验菌株,通过发酵系统的控制系统,恒 pH 6.0 自动反馈补糖培养,确保菌体在 增殖过程中不受到酸和碳源缺乏的抑制[9]。具体操作如下: 分别配制 400 g/L(C 碱)的氢氧化钠溶液和 400 g/L(C 料)的葡萄糖溶液,并分别置于补碱瓶 和补糖瓶。开启发酵罐补糖与补碱的关联系统关联比例(k)根据以下公式设置: 


 式中:40,表示氢氧化钠的摩尔分子量,g/mol;W,表示菌株代谢单位质量的葡萄糖产生的酸 摩尔数,mol/g,该值由 1.3.2 测定得到。恒 pH 自动反馈补糖过程中,每 2 h 取样,分别测定菌液 OD600、发酵液葡萄糖含量及渗透压,并在菌浓达到高时,通过平板菌落计数法测定发酵液活菌 数。并保存发酵前和发酵后的发酵液,用于测定氨基酸和肽组成变化。

1.3.5 发酵液氮源组成分析 

根据 Liu 等的方法,进行发酵液氨基酸和肽组成的测定[10]。氨基酸测定操作如下:色谱柱为 5 μm ODS  HYPERSIL(250 mm×4.6 mm),柱温 40℃,流动相 A 相:将 8.0 g 结晶乙酸钠加入 1000 mL 水搅拌使其充分溶解,之后在烧杯中加入 225 μL 三乙胺,边搅拌边滴加 5%的醋酸,将 pH 调到 7.2±0.05;后往里加 5 mL 四氢呋喃,混合后备用。流动相 B 相:将 8.0 g 结晶乙酸钠加入 400 mL 水搅拌使其充分溶解,同样滴加 2%醋酸将 pH 调到 7.2±0.05;将此溶液加入至 800 mL 乙腈和 800 mL 甲醇,混合后备用。样品前处理:取 1 mL 样液(根据终氨基酸总量对样品进行稀释),加入 1 mL 10 g/100 mL 三氯乙酸(TCA)进行 1:1 稀释,记录稀释倍数。室温下放置 1 h。用 0.22 μm 针头式 滤过滤。滤液取 1 mL 转移入 1.5 mL 的离心管中,离心(15000 r/min,30 min)。取出后,移取 400 μL 于液相小瓶中,盖上液相小瓶帽。 肽组成测定如下:色谱柱为 TSKgel 2000 SWXL(300 mm×7.8 mm),流动相是乙腈/水/三氟乙酸 =45:55:0.1(V/V)的混合溶液,流速设置为 0.5 mL/min,柱温是 30℃,紫外检测器的检测波长设定 为 220 nm。 

1.3.6 发酵液葡萄糖测定 

采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法测定发酵液中的葡萄糖浓度,按照葡萄糖测定试剂盒的指导, 具体操作如下:等体积混合试剂 1 和试剂 2,分装成 1 mL 的测试管,样品管加入 10 μL 待测样品, 标准管加入 10 μL 葡萄糖标准液,空白管加入 10 μL 蒸馏水。37℃水浴 10 min,用空白管调 0 测定样 品管和标准管在 505 nm 下的吸光度,通过以下公式计算得到葡萄糖的浓度:  葡萄糖浓度gL ⁄=样品管吸光度 标准管吸光度×标准液浓度gL ⁄  

1.3.7 发酵液渗透压测定 

发酵液离心后取 100 μL 用渗透压测定仪直接测定。 1.3.8数据统计与分析 试验中每个实验值的测定均为三次平行实验的平均值,在后期的统计分析中不再重复强调。 2 结果与分析 

2.1 罗伊氏乳杆菌生长曲线 按照 1.3.2 所述方法,对罗伊氏乳杆菌 138-1 进行生长曲线的测定。从 0 h 开始,每 2 h 测一次 OD600,直至菌体不再生长为止,绘制的生长曲线如下图。0~2 h 为延滞期,菌体生长缓慢;2~8 h 为 指数生长期,菌体快速生长繁殖;8~12 h 为稳定期,菌体生长量达到大,并且基本保持恒定;12 h 之后菌体进入衰亡期。 

1.3.8数据统计与分析 

试验中每个实验值的测定均为三次平行实验的平均值,在后期的统计分析中不再重复强调。


 2 结果与分析 


2 结果与分析

2.1 罗伊氏乳杆菌生长曲线 

按照 1.3.2 所述方法,对罗伊氏乳杆菌 138-1 进行生长曲线的测定。从 0 h 开始,每 2 h 测一次 OD600,直至菌体不再生长为止,绘制的生长曲线如下图。0~2 h 为延滞期,菌体生长缓慢;2~8 h 为 指数生长期,菌体快速生长繁殖;8~12 h 为稳定期,菌体生长量达到大,并且基本保持恒定;12 h 之后菌体进入衰亡期。

 


2.2 罗伊氏乳杆菌利用不同氮源初步分析
 

以不同氮源发酵液分批培养罗伊氏乳杆菌 138-1,根据生长过程的高生物量初步分析其对 21 种 不同氮源的利用效率,结果如表 2 所示。罗伊氏乳杆菌 138-1 对酵母提取物、酵母蛋白 103、酵母浸 粉 528、酵母浸粉 803 具有高的利用效率,其次是胰蛋白胨,对其他种类的氮源利用的效果较差, 或者基本不利用。表明罗伊氏乳杆菌对不同种类的氮源具有偏好性,同时也发现同一类别氮源对菌株 的增殖效果有差异。可能是同一类别的氮源经不同的水解工艺,产生的氨基酸和多肽组成不同,也说 明了菌株可利用的氮源分子量可能具有偏好性。 但是分批培养过程,发酵液 pH 值的降低会抑制菌体的生长,即氮源还未被利用完全,菌株即因 酸积累停止生长。4 种酵母类氮源、胰蛋白胨氮源培养基与对照 MRS 培养基分批培养罗伊氏乳杆菌 高生物量的差异没有非常显著,可能是因为不同氮源的可被有效利用的成分含量不同,亦可能是因 为不同氮源的缓冲能力不同。因此需要通过恒 pH 6.0(解除酸抑制)并补糖(自动反馈补料补充碳 源)的培养方式,进一步分析上述氮源对罗伊氏乳杆菌的增殖效率。


 

 

2.3罗伊氏乳杆菌氮源利用的选择性分析 

采用恒 pH 自动反馈补糖培养罗伊氏乳杆菌 138-1 进一步分析其利用 4 种酵母类氮源和胰蛋白胨 的增殖效率,结果如图 2 所示。罗伊氏乳杆菌 138-1 利用酵母类氮源的生长速率和大生物量显著高 于胰蛋白胨和 MRS 培养基,其中利用酵母蛋白 528 和酵母提取物生长的大生物量高,OD600分别达到 13.10±0.32 和 13.40±0.13,是胰蛋白胨和 MRS 培养基的 3 倍左右。但是,该结果不能充分说明 罗伊氏乳杆菌 138-1 对酵母提取物和酵母浸粉 528 的选择性好,菌株生长至大生物量时亦会受到 发酵体系底物浓度、渗透压和生长因子的影响。

通过连续测定发酵过程发酵液的葡萄糖浓度(图 3),发现菌株利用不同氮源发酵过程中葡萄糖 含量在一定范围内变化,但均没有出现过高或过低的情况。表明自动反馈补糖培养方式可以根据菌体 生长过程中对糖的需求自动补糖,使糖含量保持在一个稳定的范围,证实了该培养方式的可靠性,亦 排除了糖含量不足对菌体生长的影响。通过测定各氮源发酵培养基在菌株停止生长时的渗透压,发现 罗伊氏乳杆菌 138-1 利用酵母浸粉 528 生长至高生物量时,发酵液的渗透压高,达到 1618±15 mOsm/kg。根据菌株的耐渗透压实验,发现直至 MRS 培养基添加 NaCl 浓度为 36 g/L(1600 mOsm/kg 左右)罗伊氏乳杆菌 138-1 依然可以生长,排除渗透压的影响,证实各氮源培养基中菌株停 止生长不是因为渗透压的影响。

 

 

众所周知,生长因子是菌株生长必不可少的微量物质,但微生物本身却不可以合成,如果菌株生 长缺乏生长因子的话,蛋白水解系统中的酶系表达会受影响,进而严重影响其代谢增殖水平。酵母提 取物等氮源通常被认为是富含生长因子的氮源,其对罗伊氏乳杆菌 138-1 的增殖效率高可能是因为其 富含生长因子的原因。为了探究菌株不同氮源增殖浓度的不同是否因为生长因子缺乏的影响,将增殖 效果差的氮源与可能含生长因子的酵母类氮源 1:1 复合分析其对实验菌株的增殖效率。如果增殖效 果差的氮源确是因为氮源缺乏生长因子,且酵母类氮源富含生长因子,则两者氮源复合后,生长因子会促进实验菌株对效果差的氮源的利用,菌株利用复合氮源的大生物量会与利用酵母类氮源相同, 甚至更高;如果菌株利用各氮源的差异不是因为生长因子的差异,两者复合后,菌株利用复合氮源的 大生物量是利用各自氮源的大生物量的一半相加之和。通过恒 pH 自动反馈补糖培养罗伊氏乳杆 菌 138-1 利用酵母浸粉 528 与其它氮源复合的增殖效率,结果显示,复合氮源并没有提高菌株的生长 速率及大生物量。说明增殖效果差的氮源不是由于缺乏生长因子,而是本身可被罗伊氏乳杆菌 1381 利用的有效氮源含量少。 


2.4罗伊氏乳杆菌对氮源利用的特征 

通过罗伊氏乳杆菌 138-1 对不同氮源的选择性分析,证实各氮源被利用的差异,是因为各氮源中 被罗伊氏乳杆菌有效利用的氮源成分含量不同,那么罗伊氏乳杆菌利用的氮源具有什么样的特征呢? 通过分析各氮源的多肽组成(如表 3),发现每种氮源的肽分子量分布虽有差异,但分子量小于 2000 Da 的多肽含量均丰富,显著的差异是酵母类氮源中氨基酸含量高。但是,以酵母浸粉 528 氮源研 究氨基酸对罗伊氏乳杆菌 138-1 的影响,发现菌株发酵前后,氨基酸的种类和含量并没有显著降低, 其它氮源的氨基酸种类和含量亦均丰富(文中未列出),说明氨基酸并不是限制其生长的因素。 PICON 等[3]人发现 24 株乳球菌中,有 18 株菌株含有 Opp 和 Dpp,肽酶的活力是高的。杜越欧、 侯俊财等[6]人研究发现,乳酸菌主要利用氮源中的多肽,在未添加和添加了多肽的培养基中,乳酸菌 的关键酶基因表达有显著差异,说明肽含量是乳酸菌生长的一个限制因素。通过分析发酵前后各氮源 多肽的变化,发现罗伊氏乳杆菌主要利用分子量在 1000 Da 以下的肽,且对 500 Da 以下的小分子肽 利用率高。1 分子氨基酸平均 120 Da 左右,即罗伊氏乳杆菌 138-1 仅能利用二~五的小分子肽,大 分子肽及蛋白质无法利用,且利用的肽的种类主要来自于酵母类蛋白的水解产物,对其他蛋白水解得 到的肽利用很少。酵母类氮源中含有大量的小分子肽,小分子肽通过特定的肽转运系统运输到细胞 内,进一步由胞内各种肽酶降解为更小的肽和游离氨基酸以提供菌体生长利用。一些氨基酸生物合成 能力较差的菌株,只能通过编码更丰富的肽酶和肽转运系统来满足自身生长的需要[11- 12]。罗伊氏乳 杆菌不能很好地利用大分子蛋白,可能与其不能合成细胞壁蛋白水解酶有关[13],只有小分子的肽被利 用。而且不同蛋白所含的小分子肽即使分子量相近,但由于肽转运系统的底物特异性[14, 15],导致来源 不同的氮源即使分子量相同,乳酸菌也不能利用。LIU 等[16]人对乳酸菌蛋白水解体系在不同菌种之间 的差异性进行研究,发现不同菌种甚至菌株之间蛋白水解体系都有明显的差异。因此对于上述的复合 氮源结果也是吻合的,由于添加了酵母类氮源,罗伊氏乳杆菌利用其可利用的肽类,其他种类的氮源 仍然不被利用,与缺乏生长因子与否没有关系。


 

3 结论


(1)罗伊氏乳杆菌 138-1 对于不同种类的氮源具有偏好性,主要利用酵母类氮源,另外胰蛋白胨也 有一定的增殖效果。对其他种类的氮源如植物类氮源(大豆蛋白胨、水解植物蛋白等)和动物类氮源 (鱼骨蛋白胨、牛肉蛋白胨、牛骨蛋白胨等)利用效果较差或基本不利用。

(2)通过恒 pH 自动反馈补糖培养罗伊氏乳杆菌 138-1,酵母浸粉 528 和酵母提取物的增殖效率 高,大生物量分别达到 13.10±0.32 和 13.40±0.13,是 MRS 的 3 倍左右。

(3)罗伊氏乳杆菌 138-1 氮源利用的选择性归因于氮源本身可被菌株有效利用的氮源含量,与生长 因子无关。

(4)添加了酵母浸粉 528 的培养基,发酵前后游离氨基酸都是充足的,证明氨基酸不是罗伊氏乳杆 菌的限制性底物,肽含量可能是菌株的生长限制性底物。而且发酵前不同种类氮源肽含量均丰富,但 是菌株利用却有差异性。酵母类氮源原料是酵母蛋白,整体的分子量都集中在 500 Da 以下;乳基蛋 白原料是水解酪蛋白,动物类蛋白和植物类蛋白原料都是大分子的组织蛋白,可以看出罗伊氏乳杆菌 可能对氮源种类具有偏好性。

(5)罗伊氏乳杆菌 138-1 对于同一种类的氮源也具有偏好性。虽然罗伊氏乳杆菌对微生物类氮源具 有偏好性,但是当 1000 Da 氮源肽段含量丰富时,菌株的比生长速率和高生物量都会显著升高,尤 其是 180~500 Da 之间利用率高。本实验结果对于工业上罗伊氏乳杆菌的增殖具有极其重要的指导 意义,同时可以结合蛋白水解技术,将廉价的蛋白原料经过蛋白酶水解,使其水解底物的肽段集中在 180~500 Da 之间,可以直接用于罗伊氏乳杆菌的增殖培养。对于不同的氮源,也可以直接推断出罗伊 氏乳杆菌的增殖效果,此举减少了大量的人力物力,对未来罗伊氏乳杆菌的利用起到了很大的推动作 用,而且不仅仅是罗伊氏乳杆菌,其他的乳酸菌也是可以同样找到规律。


文献参考

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相关论文已发表:原文链接 https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.017734 

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注:本文转载自https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.017734 ,由迪必尔生物小编整理发布,感谢此资源提供者。如有任何建议或意见等,请您加小编微信(13918007863)交流互动。



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