全国服务热线:
021-57640001
国内首家将微小型平行生物反应器成功商业化的研发和制造商
您身边的平行生物反应器专家

Emil:gentle@bioreactors.cn

通过代谢工程改造地衣芽孢杆菌强化ATP供给促聚γ-谷氨酸高产
来源:陈守文教授 | 作者:陈守文教授 | 发布时间: 2018-07-30 | 481 次浏览 | 分享到:
γ-PGA是一种以D型和L型谷氨酸为单体的天然多功能生物聚合物。因其具有阳离子螯合、吸湿、水溶、无毒和可生物降解性等多种特性已经被广泛应用在医药、食品和水处理、日化和农业行业。例如已经证实的应用包括作为材料和药物载、食品防腐剂、金属离子螯合剂、高吸水性凝胶和肥料促进剂 (Luo et al., 2016; Ogunleye et al., 2015)。


Enhanced production of poly-Y-glutamic acid by improving ATP supply
 in metabolically engineeredВ Bacillus licheniformis 

Biotechnol Bioeng. 2018 Jun 25. doi: 10.1002/bit.26774. [Epub ahead of print]
Enhanced production of poly-γ-glutamic acid by improving ATP supply in metabolically engineered Bacillus licheniformis.
Cai D1, Chen Y1, He P1, Wang S1, Mo F1, Li X2, Wang Q1, Nomura CT1,3, Wen Z4,5, Ma X1, Chen S1.



通过代谢工程改造地衣芽孢杆菌强化ATP供给促聚γ-谷氨酸高产


(迪必尔生物编辑部 Kyle Liu 译 上海 0180730)

 摘 要 

γ-谷氨酸(γ-PGA)是一种重要的多功能生物聚合物,应用广泛,三磷酸腺苷(ATP)供应在其生物合成中起着至关重要的作用。本研究中通过尝试多途径改造强化地衣芽孢杆菌中ATP供应水平来提高γ-PGA产量。 第一种策略是优化地衣芽孢杆菌呼吸链分支途径,通过阻断细胞色素bd氧化酶途径,降低了细胞维持系数,使得γ-PGA产量提高19.27%。第二种方法是将透明颤菌血红蛋白(VHB)引入地衣芽孢杆菌中,使得γ-PGA产量提高13.32%。 在第三种策略中,通过分别强化ATP生物合成途径中关键基因purB和adK发现,adK过表达菌株使得γ-PGA产量提高14.69%。 我们的研究还证实,地衣芽胞杆菌中呼吸硝酸盐还原酶NarGHIJ负责将硝酸盐转化为亚硝酸盐,而同化硝酸盐还原酶NasBC则用于将亚硝酸盐转化为氨。NarGHIJ和NasBC都受到双组分系统ResD-ResE的正调节作用,NarG,NasC和ResD的过表达均可以提高了ATP供应水平和γ-PGA产量。 基于上述各方法,结合cydBC基因缺失和基因vgB,adK和resD过表达,将细胞的ATP含量增加至3.53μmol/ g DCW,由此得到的突变株WX-BCVAR的γ-PGA产量为43.81 g/L的,与野生菌株WX-02相比提高了38.64%。 总的来说,我们的结果表明增强ATP供给水平是提高地衣芽孢杆菌中γ-PGA产量的有效策略。

 关键词 

ATP供应, 地衣芽孢杆菌,代谢工程,聚γ-谷氨酸

 

 第一部 引言 

γ-PGA是一种以D型和L型谷氨酸为单体的天然多功能生物聚合物。因其具有阳离子螯合、吸湿、水溶、无毒和可生物降解性等多种特性已经被广泛应用在医药、食品和水处理、日化和农业行业。例如已经证实的应用包括作为材料和药物载、食品防腐剂、金属离子螯合剂、高吸水性凝胶和肥料促进剂 (Luo et al., 2016; Ogunleye et al., 2015)

芽孢杆菌被证明能够作为生产菌,能有效利用体内的谷氨酸作为前体生成γ-PGA (Luo et al., 2016) 。目前人们已经开发了多种策略来改造芽孢杆菌的聚谷氨酸合成途径以提高γ-PGA产量。例如,在解淀粉芽孢杆菌LL3中,通过阻断胞外多糖和脂多糖的合成途径,降低了竞争副产物的产量,从而提高了γ-PGA产量(Feng et al., 2015)。通过敲除抗生素编码基因簇itu,bae,srt,和fen,使的γ-PGA的产量提高了35%(Gao et al., 2017)。敲除γ-PGA水解酶基因pgds和cwlO,也可以提高γ-PGA产量(Scoffone et al., 2013)。

γ-PGA产品本身的高粘度是其高水平生产的一个主要障碍。其有可能在发酵后期阻碍氧传递,影响三磷酸腺苷(ATP)供给。因为在谷氨酸转化成γ-PGA过程中需要消耗ATP,因此,ATP供给不足是γ-PGA生产的瓶颈(Cadelna & Fouet, 2006)。改造γ-PGA生产菌株的代谢途径, 增强细胞内ATP合成,是缓解ATP不足问题的一个方式。据我们所知,目前很少有人尝试通过增强ATP来提高γ-PGA产量。

在微生物细胞中,ATP在不同的代谢途径中发挥着不同的作用,比如作为底物、产物、激活物或抑制剂。总的来说,可以通过调节NADH、氧化途径、供氧、质子梯度和F0F1‐ATP酶活性以及工程化电子传递链来调节ATP供给(Wu et al., 2016; Zhou, Liu, Shi, Du, & Chen, 2009)。例如,通过在枯草芽孢杆菌中去除编码细胞色素bd泛素氧化酶(subunit II)和ATP结合蛋白的基因cydB和cydC,降低了工程菌株的维持代谢系数,使得核黄素产量增加38%,N -乙酰氨基葡萄糖产量增加了40%(Liu et al., 2014;Zamboni, Mouncey, Hohmann, & Sauer, 2003). 通过过表达透明颤菌血红蛋白(VHB)来提高ATP的供应,提高了透明质酸 (Lu et al., 2016), γ-PGA(Su et al., 2010),和杀虫晶体蛋白(Liang, Shouwen, Ming, & Ziniu,2007)的产量。此外,过表达磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的也可以改善ATP的供应和代谢物产量(Liu et al., 2012)。谷氨酸棒杆菌中,通过删除编码NADH氧化酶的noxA基因和编码AMP核苷酶的amn基因,提高了细胞内ATP的供给水平,使得精氨酸产量增加17.2%(Man et al., 2016).之于γ-PGA,人们也探索了一些通过强化ATP合成来提高γ-PGA产量的方法。例如,添加硝酸盐作为电子受体改善了ATP供应, 使得γ-PGA产量提高2.3倍(Li et al., 2014).过表达VHB也可以用来提高ATP供应和γ-PGA产量(Su et al., 2010)。由于其生物合成的要求,加强ATP的供应可能是提高γ-PGA产量的一个有效方法。

地衣芽孢杆菌 WX-02被证明是一个有潜力的γ-PGA生产菌株(Wei, Ji, &, Chen, 2010)。强化γ-PGA水解酶PgdS和谷氨酸消旋酶Glr的过表达(Jiang et al., 2011; Tian et al., 2013)和NADPH再生(Cai, He, et al., 2017)等均可以提高该菌株中γ-PGA的产量。本研究中,我们探索了提高γ-PGA产量的方法,通过电子传递链优化,引入VHB提高氧气传递速率,提高硝酸盐代谢和ATP合成的代谢通量来强化ATP供给,从而提高γ-PGA产量(图1)。最后,通过运用组合代谢工程进一步提高γ-PGA产量。通过提高ATP供应,我们可以提高γ-PGA产量,并得到了有潜力的菌株用于工业化生产产γ-PGA。

第二部分  材料和方法

2.1 菌株和质粒

本实验所使用的菌株和质粒见表1。地衣芽孢杆菌 WX‐02 (CCTCC M208065) 作为构建重组菌株的出发菌株。质粒pHY300PLK用于构建表达载体,使用穿梭质粒T2‐Ori用于基因敲除和整合表达载体的构建。所有此实验所用到的引物见附表S1

2.2培养基和培养条件 

LB培养基作为基本培养基,其每升含10g蛋白胨,5g酵母提取物,和10g NaCl(pH7.2),需要时加入必要的抗生素(20mg/L卡那霉素,20mg/L四环素,或50mg/L氨苄青霉素)。地衣芽孢杆菌和大肠杆菌培养温度均为37°C。γ-PGA的合成培养基(BFC培养基)每升含80g葡萄糖,10g柠檬酸钠,8g NH4Cl, 1g CaCl2, 1 g K2HPO4·3H2O, 1 g MgSO4·7H2O, 1 g ZnSO4·7H2O 和0.15 g MnSO4·7H2O,调pH 7.2. BFC培养基中添加120 mmol/L NaNO3 和 120 mmol/L NaNO2分别作为BFCNA和BFCNI培养基(Li et al., 2014). 种子在250ml摇瓶中制备,含50ml的LB培养基,37C摇床(180rpm)培养10小时到OD600达到4.0-4.5。然后接种到γ-PGA合成培养基中(接种量3%)。γ-PGA的发酵条件和种子培养条件相同。所有实验三组平行对照。
图1

图1.提高ATP供应水平用于γ-PGA高产。a) 地衣芽孢杆菌的呼吸链分支。通过分别敲除 cydB 和cydC 这两个编码细胞色素bd泛醇氧化酶(第二亚基)和 ATP结合蛋白的基因,
阻断细胞色素bd氧化酶分支途径,从而降低细胞维持代谢系数用于γ-PGA高产。
 b) 加入VHB提高γ-PGA的氧传递 c) 通过purB基因(编码腺苷酸琥珀酸裂合酶)和adk基因(编码腺苷酸激酶)的过表达来加强ATP合成途径,
进而提高γ-PGA合成过程中的ATP供应水平 d) 地衣芽孢杆菌的硝酸代谢途径。基因narG (编码呼吸硝酸还原酶亚基),
基因nasC(编码同化硝酸还原酶催化亚基)和基因resD(编码双组份转录调控蛋白)分别过表达来提高γ-PGA合成过程中的ATP供应水平。





表1
表1.本实验所使用的菌株和质粒

2.3 地衣芽孢杆菌的基因敲除

地衣芽孢杆菌基因敲除的方法在我们过去的论文中有描述(Cai et al., 2016)。在这里,以构建cydB缺陷菌株为例。简言之,以地衣芽孢杆菌WX‐02基因组DNA为模板,采用引物cydB‐KF1/R1和cydB‐KF2/R2扩增得到cydB基因的上游和下游同源臂,经重叠扩展(SOE)‐PCR得到融合片段。融合片段被插入到限制酶位点XbaI/SacI酶切后的T2(2)‐Ori中。菌落PCR和DNA测序证实重组质粒(T2‐cydB)构建成功。

    将重组质粒T2‐cydB电转化至WX‐02,通过菌落PCR和质粒抽提证实转化成功。阳性转化子首先在含20mg/L卡那霉素的LB培养基中, 45℃条件下培养促进单交换发生,然后在无卡那霉素培养基中37℃培养。卡那霉素敏感菌落经菌落PCR验证,获得双交换转化株。这个突变株经DNA测序后证实,并命名为WXΔcydB。其他的基因(ythA, ctaC, qoxA, cydC, narG, nasC, resD)的敲除采用相同的方法。

2.4 基因表达载体的构建

    基因表达载体的额构建参照之前发表的方法(Cai et al., 2016), 我们以narG过表达载体的构建举例。简言之,采用引物分别扩增枯草芽孢杆菌P43启动子,编码呼吸型硝酸还原酶基因narG,淀粉酶终止子序列amyL,并用SOE-PCR将三个片段融合到一起。融合的片段插入至限制性内切酶EcoRI/XbaI切后的PHY300PLK。菌落PCR和DNA序列证实重组质粒(pHY-narG) 构建成功。采用相同的方法构建了其他基因(vgB, purB, adK, nasC, and resD))的表达载体。

2.5 地衣芽孢杆菌中基因整合

为了构建同时过表达vgb, adK, 和 resD基因的菌株,按照之前发表的方法将P43启动子介导的单个基因整合到地衣芽孢杆菌的染色体中(Cai, Wang, et al., 2017). 通过菌落PCR和DNA测序对重组菌株进行验证

2.6 测定细胞生物量,γ-PGA产量和葡萄糖

细胞生物量通过细胞干重来测量。γ-PGA浓度通过高效液相色谱参照之前描述的方法完成(Wang, Yuan, Wei, Chen, & Chen, 2015). 葡萄糖浓度通过SBA-40C生物分析仪测定(中科院,山东)。

2.7 ATP含量测定

ATP含量通过之前发表的方法测量(Li et al., 2014)。简言之,1ml 发酵液加4ml水,4℃12000g离心10分钟,沉积细胞加入200 μL裂解缓冲液再次混悬置于4℃。ATP浓度测定基于ATP检测试剂盒使用手册(碧云天,中国),换算成单位细胞干重的ATP含量

2.8 分析方法

硝酸盐是由水杨酸法测定的。亚硝酸盐有先前Nicholas和Nason的重氮偶联法测定 (Cataldo, Maroon, Schrader, & Youngs, 1975; Nicholas & Nason, 1957)。采用气相色谱测定乙二醇和丁二醇的含量(Qiu et al.,2016)。维持系数是根据以前发表的方法确定的(Liu et al., 2014). 采用Pirt模型对维持系数进行测量如下:

qglc = μ/Ymax + mglc.

其中qglc为比葡萄糖消耗速率(mmol/g DCW/h), μ是比生长速率,Ymax是最大产量((g DCW/mmol), mglc.是维持系数(mmol/gDCW/h).

2.9 基因转录水平的测定

重组菌株的基因转录水平按照之前发表的方法分析(Cai, He, et al., 2017).细菌总RNA由TRIzol®试剂提取,微量DNA由脱氧核糖核酸酶I消化,互补DNA(cDNA)的第一条链由cDNA合成试剂盒(Thermo Fisher Scientific)扩增。地衣芽孢杆菌WX-02的16S rRNA作为内参基因。重组菌株的基因转录水平通过对内参基因16S RRNA归一化处理后得到。所有实验三组平行对照。

2.10 在MiniBox)1L生物反应器中生产γ-PGA

   菌株WX-02和WX-BCAVR的γ-PGA分批发酵实验在1L发酵罐(迪必尔生物工程上海有限公司)中完成,采用0.6LBFCNA培养基。初始pH和接种量分别为7.2和3%,搅拌速度为400rpm。尾气中的O2和CO2的含量由尾气分析仪测量,氧传递速率(OTR),二氧化碳释放率(CER),呼吸熵(RQ)和溶氧传递系数(KLa)由尾气分析装置计算得到(迪必尔生物工程上海有限公司)。




2.11 统计分析

    所有的样品三份平行分析,提供的数据为每个样本点的平均值±标准偏差。所有数据均分析p<0.05和p < 0.01的方差,并在测试时使用软件包Statistica 6.0对均值进行比较Cai, Wang, et al., 2017).


图2
图2.单个呼吸链基因缺失对γ-PGA产生,ATP浓度,细胞正常和维护系数的影响。
(a)γ-PGA产量;(b)ATP浓度;(c)细胞生长;(d)维持系数。
数据表示为三次重复的均值,柱形代表标准偏差,*p < 0.05;**p < 0.01表示重组菌株与对照菌株的显著性水平。

 第三部分 结果 

3.1 单个呼吸链基因的缺失对γ-PGA产生,ATP含量和细胞生物量的影响

    地衣芽孢杆菌中有四条呼吸链,包含(a)细胞色素caa3氧化酶,(b)细胞色素aa3氧化酶,(c)细胞色素bd氧化酶 和(d)YthAB 氧化酶,其分别由ctaCDEF, qoxABCD, cydABCD, 和 ythABC编码(Winstedt, Yoshida,Fujita, & von Wachenfeldt, 1998)。本实验中,这四条途径通过敲除相应的基因被单独阻断,产生的菌株分别命名为WXΔcatC, WXΔqoxA, WXΔcydB,和WXΔythA

    将上述四个突变菌株和对照菌株WX-02在BFCNA培养基中进行培养。通过测定γ-PGA产量,ATP含量和细胞生物量来评估每条呼吸链阻断对γ-PGA合成的影响。如图2a所示,与对照菌株相比,cydB缺陷菌株WXΔcydB 的γ-PGA产量提高了15.42%, 而突变株WXΔqoxA 和WXΔythA的γ-PGA产量则分别降低了14.17%和21.05%。与原始菌株WX-02相比,WXΔcydB的ATP含量(2.61 μmol/g DCW)增加了17.38%,而缺失qoxA和ythA会减少ATP含量(图2b)。另外,与WX-02相比,cydB和cydC缺陷菌株的最大细胞生物量分别增长了8.88%和5.51%,每克细胞的γ-PGA产量分别提高了5.64%和6.18%。qoxA和ythA的缺失降低了细胞生长,不利于γ-PGA的合成(图2c)。研究结果还表明,与WX-02相比,cydB缺陷菌的维持系数降低了17.89%(0.37mmol/g DCW/h), ythA和qoxA的缺失则提高了维持系数。ctaC的缺失对γ-PGA产量,细胞生长,ATP含量和维持系数没有显著影响(图2)。此外,细胞色素bd泛素氧化酶ATP结合蛋白基因cydC的缺失也会降低细胞代谢系数,促进ATP供给和γ-PGA产量的增加。

另外,构建了cydB和cydC双突变株,命名为WX-BC,从而进一步阻断细胞色素bd氧化酶分支途径。WX-BC在所有突变株中表现最为突出,其最大γ-PGA的产量为37.60g/L,比WX-02高了19.27%。与对照菌WX-02相比,WX-BC的最大ATP含量和细胞生物量分别提高了22.08%和13.21%。WX-BC的最大γ-PGA产率为5.92g/g DCW,比WX-02的5.53g/g DCW高了7.05%,同时WX-BC的维持系数(0.34mmol/g DCW/h)与WX-02(0.45mmol/葡萄糖, 图2d)相比降低了24.45%。总之,结果证实,地衣芽胞杆菌细胞色素bd氧化酶分支途径具有较高的维持代谢能,阻断这一分支是有利于ATP供应和γ-PGA生产。



图3
3. 引入透明颤菌血红蛋白(VHB)对γ-PGA,细胞生长和ATP浓度的影响。
(a) γ-PGA产量和细胞生物量;(b) ATP浓度(16和24小时)。

数据表示为三次重复的均值,柱形代表标准偏差,
*p < 0.05;**p < 0.01表示重组菌株与对照菌株的显著性水平。


3.2 引入VHB促进ATP供给和γ-PGA合成

       之前的工作证实了引入VHB可以提高氧传递速率,有利于代谢物的高产(Su et al., 2010). 在本实验中,将编码VHB的vgB基因引入WX-02,得到重组菌株WX/pHY-vgb。与WX/pHY-300相比,WX/pHY-vgb的最大γ-PGA产量提高了13.32% (图3a)。WX/pHY-vgb最大ATP含量为2.73 μmol/g DCW, 与WX/pHY-300(2.37 μmol/g DCW)相比提高了15.1%。因为VHB在微氧条件下活力更强,所以在发酵后期(24小时)测量的ATP含量相比于对照菌株增加了66.27%(图3b)。上面的结果清楚地表明,VHB的引入提高了γ-PGA生物合成过程中的ATP供应,尤其是微氧条件下。


3.3 强化ATP合成途径及其对γ-PGA合成的影响 

    强化ATP合成途径从而提高γ-PGA生产过程中ATP的供应。由于编码的腺苷酸琥珀酸裂解酶基因purB和编码的腺苷酸激酶基因adK是细菌ATP合成的主要基因(Wang et al., 2016), 通过分别对这两个基因过表达提高WX-02的ATP供应。重组菌株分别命名为WX/pHY‐purB and WX/pHY‐adK。 

     WX/pHY‐adK表现出最高的γ-PGA产量和ATP含量。WX/pHY‐adK中γ-PGA的产量(34.42g/L)提高了14.69%, 其ATP含量为3.03μmol/g DCW,相比比于WX/pHY300 (2.37 μmol/g DCW)提高了27.85%(图4b)。purB的过表达也提高了ATP含量和γ-PGA产量。综上,我们的结果表明通过purB和adK的过表达强化了ATP合成途径,提高了ATP含量和γ-PGA产量。



图4


图4. 过表达purB和adK对γ-PGA产量,细胞生长和ATP浓度的影响。
(a) γ-PGA产量和细胞生物量(b)ATP浓度。
数据表示为三次重复的均值,柱形代表标准偏差,*p < 0.05;**p < 0.01表示重组菌株与对照菌株的显著性水平。


3.4 narG, nasG和resD的缺失及其对γ-PGA产量,硝酸代谢和ATP含量的影响

我们之前的研究表明,硝酸代谢在ATP供应中具有重要作用,因而会影响γ-PGA的高产(Li et al., 2014)。基于地衣芽孢杆菌WX-02的基因组序列注释,有两个硝酸还原酶存在于WX-02中,即,由narGHIJ编码的呼吸型硝酸还原酶和nasBC编码的亚同化型硝酸还原酶(Yangtse et al., 2012)。据报道,硝酸盐代谢受双组分调节因子ResD-ResE的调控(Geng, Zhu, Mullen, Zuber, & Nakano, 2007). 在该研究中,基因narG和nasC分别被敲除以阻断WX-02中的呼吸型硝酸盐还原酶和同化硝酸盐还原酶途径。得到的缺陷菌株分别命名为WXΔnarG和WXΔnasC。与此同时,也构建了基因resD缺陷菌株WXΔresD。

如图5a显示,WX‐02, WXΔnarG, WXΔnasC 和WXΔresD的γ-PGA产量在BFC培养基中没有明显差异。但是当在BFCNA培养基中培养时,WXΔnarG, WXΔnasC, 和 WXΔresDγ的γ-PGA的产量分别为9.74, 13.32 和 9.67 g/L, 比WX-02(31.60g/L)低很多。在BFCNI培养基中,这些突变菌株的γ-PGA产量与WX-02相比分别减少了25.32%,42.78%和43.64%(图5a)。基于以上结果,添加硝酸盐会提高WX-02的γ-PGA产量1.97倍。但是,它对WXΔnarG 和 WXΔresD的γ-PGA产量略有负面影响。还有,由于nasC缺失,与WX-02相比,在BFCNA培养基中γ-PGA的合成能力也减弱了。同时,nasC和resD的缺失对BFCNI培养基中γ-PGA的产生有有重要影响,并且在narG缺陷菌株中γ-PGA的合成能力也降低了。

此外,还测定了在BFCNA培养基中生长的WX-02,WXΔnarG,WXΔnasC和WXΔresD的硝酸盐消耗和亚硝酸盐积累情况。WX-02在24小时内完全消耗硝酸盐,WXΔresD和WXΔnarG几乎不消耗硝酸盐,WXΔnasC消耗33.28%硝酸盐。就亚硝酸盐积累而言,与WX-02相比,在WXΔresD和WXΔnarG中几乎没有累积亚硝酸盐,并且过量的亚硝酸盐在WXΔnasC中积累(图5b,c)。 与WX-02相比,narG,nasC和resD缺陷菌株的ATP含量分别下降70.84%,45.12%和74.79%(图5d)。



图5
图5. narG, nasC和resD缺失对γ-PGA合成,硝酸盐代谢和ATP浓度的影响。
(a) BFC, BFCNA和BFCNI 培养基中WX‐02, WXΔnarG, WXΔnasC, 和 WXΔresDγ-PGA产量。
(b)BFCNA 培养基中WX‐02, WXΔnarG, WXΔnasC, 和 WXΔresD 硝酸盐浓度变化曲线。
(c) BFCNA 培养基中WX‐02, WXΔnarG, WXΔnasC, 和 WXΔresD 亚硝酸盐浓度变化曲线 (d)BFCNA 培养基中WX‐02, WXΔnarG, WXΔnasC, 和 WXΔresD ATP浓度


3.5 NarG,NasC和ResD的强化及其对γ-PGA产量,硝酸盐代谢和ATP含量的影响

随后,构建了narG, nasC和resD过表达菌株来提高硝酸盐代谢和ATP供应。基于质粒pHY300PLK构建相应表达载体,重组菌株分别命名为WX/pHY‐narG, WX/pHY‐nasC, 和WX/pHY‐resD。


从图6可以看出narG, nasC,和resD的过表达均可以提高γ-PGA的产量,产量最高的是resD过表达菌株。与WX/pHY‐300相比,突变株WX/pHY‐resDγ-PGA的产量提高了14.95% (图6a),在BFCNA培养基中的硝酸盐和亚硝酸盐的消耗也很快(图6b,c)。NarG和NasC的过表达也分别提高了硝酸盐和亚硝酸盐在BFCNA培养基中消耗速率 (图6b,c)。与WX/pHY300相比, narG, nasC, 和 resD 过表达菌株的ATP含量分别增加了10.24%, 11.86% 和21.23%(图6d)。总之,上述结果表明resD,narG和nasC在BFCNA培养基中的γ-PGA生成中起重要作用,并且NarG,NasC和ResD的过表达强化了ATP供应和γ-PGA产量。此外,硝酸代谢中基因(narK,narG,nasD和fnr)的转录水平在resD缺失菌株WXΔresD中显著降低,在resD过表达菌株WX / pHY-resD中均有所增加(附属材料图S1和S2)。上述结果表明,双组分调节因子ResD-ResE在γ-PGA生产过程中正调节硝酸盐代谢,呼吸型硝酸盐还原酶NarGHIJ起硝酸盐还原作用,同化硝酸盐还原酶NasBC影响亚硝酸盐还原的效率。

图6


6. 过表达NarG, NasC,和ResD对γ-PGA产量,硝酸盐代谢和ATP浓度的影响 (a)  
BFC, BFCNA,和 BFCNI培养基中WX/pHY‐300, WX/pHY‐narG, WX/pHY‐nasC和WX/pHY‐resD的γ-PGA产量。
(b) BFCNA培养基条件下WX/pHY‐300, WX/pHY‐narG, WX/pHY‐nasC和WX/pHY‐resD 的硝酸盐浓度 (c) BFCNA 培养基条件下WX/pHY‐300, WX/pHY‐narG, WX/pHY‐nasC,
和 WX/pHY‐resD的亚硝酸盐浓度. (d) BFCNA 培养基条件下W X/pHY‐300, WX/pHY‐narG, WX/pHY‐nasC,和 WX/pHY‐resDATP浓度。



3.6 组合代谢工程提高γ-PGA生产

组合代谢工程是提高目标代谢产物产量的一种有效策略(Jeschek, Gerngross, & Panke, 2017; Yu, Juwono, Foo, Leong, & Chang, 2016).。在本研究中,我们通过同时敲除cydBC,引入vgB以及过表达adK和resD来实现。由P43启动子介导的基因vgB,adK和resD通过在WX-BC中的整合逐步表达。首先,将基因vgB整合到WX-BC的染色体中,得到菌株WX-BCV。WX-BCV的ATP含量和γ-PGA产量分别为2.95 μmol/g DCW和 39.47 g/L,相比WX-02分别增加了32.28%和24.91%。随后,构建AdK过表达菌株WX-BCVN,使得ATP含量增加42.05%,γ-PGA产量提高31.23%。最后,由P43启动子介导的基因resD整合到WX-BCVA的染色体中,产生最终的菌株WX-BCVAR (表2)。结果显示WX-BCVAR生成ATP(3.53 μmol/g DCW)比WX-02多58.03%(表2), γ-PGA的最大产量可达43.81g/L,比WX-02提高了38.64% (支持信息图S3)。还发现在γ-PGA合成过程中乙偶姻和2,3-丁二醇(两种主要副产物)的产量在WX-BCVAR中显着下降(表2和图7)。此外,由于γ-PGA的分子量主要受γ-PGA解聚酶基因表达水平的控制,该基因在本研究中未发生改变。 因此,在基因改造过程中γ-PGA的分子量没有变化。

    此外,为了评估基因改造对γ-PGA发酵过程中供氧效率的影响,在1L发酵罐中对WX-02和WX-BCVAR进行了培养,在发酵过程中对葡萄糖浓度,γ-PGA产量,细胞生物量和和KLa进行了测量(图7)。 我们的研究结果表明,WX-BCVAR在整个发酵过程中消耗葡萄糖的速度更快,γ-PGA的产率高于WX-02,最大γ-PGA产量为46.59 g / L,与WX-02(34.19克/升)相比增加了36.28%。此外,每克细胞产生的γ-PGA为6.86g / g DCW,比WX-02(5.96g / g DCW)提高了15.20%。 由于引入VHB可以提高OTR,WX-BCVAR的KLa在整个发酵过程中均高于WX-02,最大KLa达到225.85 每小时,比WX-02提高20.05%。 (187.19每小时;图7)。 WX-BCVAR的OTR和CER分别为13.90和16.67mmol/L/h,与WX-02(11.46和17.49mmol/L)相比,分别降低了21.29%和4.69%。 因此,WX-BCVAR的RQ(1.20)比WX-02(1.53)的RQ低21.42%。




表2


表2. 突变株的ATP含量,细胞生物量,γ-PGA产量和主要副产物乙偶姻/2,3-丁二醇的产量




图7
图7. WX-02和WX-BCVAR在1L发酵罐中合成γ-PGA的发酵过程曲线。(a)葡萄糖浓度;(b)细胞生物量;(c) γ-PGA产量;(d) KLa


 第四部分  讨论 


γ-PGA是一种绿色多功能生物聚合物,其具有多种应用,具有阳离子螯合,吸湿性,水溶性,无毒性和生物降解性等特点,γ-PGA被认为是聚丙烯酰胺的良好替代品。因此,开发有效的γ-PGA生产技术具有广阔的市场前景。 最近,已经尝试了许多方法来改善γ-PGA产率,包括消除副产物合成途径,谷氨酸合成途径的强化和γ-PGA水解酶基因的敲除(Feng et al., 2015, 2017; Scoffone et al., 2013).。由于谷氨酸转化成γ-PGA需要消耗ATP,所以充足的ATP供应对于高水平γ-PGA合成至关重要(Su et al., 2010; Tang et al., 2016; Zhang et al., 2013). 然而,由于γ-PGA发酵过程中ATP产生和消耗不平衡,γ-PGA生产微生物经常受到ATP缺乏的阻碍。这种代谢相关的ATP缺乏与γ-PGA发酵的工程操作相结合,因为γ-PGA发酵液的高粘度阻碍了氧转移和ATP供应(Li et al., 2014)。在这项研究中,我们专注于改善ATP供应作为增强γ-PGA合成的有效方法。 我们的研究结果表明,呼吸链的优化,VHB的引入,ATP合成和硝酸盐代谢途径的强化等几种策略均可以达到提高ATP供应和γ-PGA产量的目的。在该研究中,最终菌株WX-BCVAR在250ml摇瓶中培养32小时,γ-PGA的产率为43.81g / L,每克细胞产生的γ-PGA产量为6.61g / g DCW。 此外,附属材料S3提供了之前研究中报道的γ-PGA产率,我们的结果表明在该研究中获得的γ-PGA产量是迄今为止在摇瓶条件下的最高产率。

    与其他细菌相比,产生γ-PGA的地衣芽孢杆菌通常具有高测定维持代谢系数,这对γ-PGA合成是不利的。 减少呼吸链中的维持是提高γ-PGA产量的有效方法。 据报道,细菌色素途径和泛醇氧化酶途径是组成芽孢杆菌呼吸链径,aa3和bd泛醇氧化酶是芽孢杆菌的主要呼吸链途径(Tannler, Decasper, & Sauer, 2008).bd氧化酶链由cydAB编码的bd氧化酶催化,其中一个质子与一个电子一起传输; 因此,该条途径被认为是电子转移的低效途径。 在这项研究中,cydBC突变株的γ-PGA产量增加了19.27%,我们的结果与之前的报告一致(Liu et al.,2014; Zamboni et al., 2003)。同时,据报道cydABCD操纵子与氧气的亲和力更高,特别是在微氧条件下(Winstedt et al., 1998). 因此,缺失cydBC可能不利于γ-PGA发酵后期的氧传递,这可能是WX-BC(19.27%)γ-PGA产量提高率低于在先前的研究中采用同样策略得到的核黄素(38%)和N-乙酰氨基葡萄糖(40%)的产量提高率的原因(Liu et al., 2014; Zamboni et al., 2003)。尽管如此,cydBC的缺失可以改善细胞生长和ATP供应,这有利于γ-PGA的合成。 作为芽孢杆菌的另一个主要呼吸链,消除aa3途径增加了细胞的维持,从而降低了γ-PGA的产量。 同时,在ythAB缺陷菌株中ATP含量和γ-PGA产量降低。 由于YthAB氧化酶途径通过染色体序列比对被鉴定为呼吸链分支途径的(Winstedt et al., 1998),因此,后续需要更多的研究来阐述这种机制。

由于VHB可以提高氧传递,特别是在微氧条件下,例如高密度γ-PGA发酵,因此,引入VHB已被用于改善ATP供应(Su et al., 2010). 本研究中,24小时ATP含量的提高率高于16小时表明VHB在微氧条件下更有效。 此外,改进氧传递也会产生有益的副作用。 例如,地衣芽孢杆菌中2,3-丁二醇的合成需要低O2水平,因此,VHB过表达菌株中氧转移的改善抑制2,3-丁二醇合成,这最终将有利于γ-PGA生产(Celinska & Grajek, 2009).

      在微生物细胞中,硝酸盐被两条途径还原,通过反硝化产生氮氧化物和通过氨化产生氨。 这两种还原途径分别由呼吸硝酸还原酶和同化硝酸还原酶催化(Gonzalez, Correia, Moura, Brondino, & Moura, 2006; Morozkina & Zvyagilskaya, 2007). 我们的结果表明,呼吸和同化硝酸盐还原酶参与γ-PGA合成过程中的硝酸盐代谢。 并确证了呼吸硝酸还原酶NarGHIJ催化硝酸盐转化为亚硝酸盐,同化硝酸还原酶NasBC的表达水平则会影响亚硝酸盐的还原。由于基因nasBC紧挨着亚硝酸盐还原酶基因nasDEF(负责亚硝酸盐还原),我们假设同化硝酸盐还原酶NasBC是NasDEF表达所必需的。 同时,resD的缺失降低了narK,narG,nasD和fnr的表达水平(附属材料图S1),这影响了硝酸盐代谢,ATP供应和γ-PGA产生。这些基因的表达水平在ResD过表达菌株中均显著增加(附属材料图S2)。 因此,证实了narG和nasC的表达水平受ResD和厌氧转录因子基因fnr的正调控。 以往的研究表明,Fnr直接激活硝酸还原酶NarGHIJ的表达,磷酸化ResD的表达水平受到正向调节(ResD–Pi; Figure 1; Hartig & Jahn, 2012; Reents, Munch, Dammeyer, Jahn, & Hartig, 2006).。因此,我们的结果表明ResD-E通过操纵Fnr的表达水平调节NarGHIJ的表达水平。 同时,据报道,亚硝酸盐还原酶NasDEF受氮调节剂TnrA和ResD-P的正调节,因此,ResD可能通过直接调节NasDEF的表达水平而影响亚硝酸盐还原(Figure 1; Nakano, Hoffmann, Zhu, & Jahn, 1998)


  第五部分 结论 第五部分  结论

本研究中,呼吸链途径,VHB,ATP合成途径和硝酸盐代谢途径被改造用于提高地衣芽孢杆菌中的ATP供应和γ-PGA合成水平。基于我们的结果,cydBC的缺乏降低了地衣芽孢杆菌的维持代谢,并且鉴定了ResD-ResE,NarGHIJ和NasBC在γ-PGA合成中的重要作用。 cydBC的缺乏,VHB的引入以及ATP合成和硝酸盐代谢途径的强化均可以提高了ATP供应和γ-PGA产量。上述策略的组合代谢工程改造有效地将最终菌株WX-BCVAR中的ATP含量和γ-PGA产量分别提高了58.30%和38.64%,同时减少了副产物乙偶姻和2,3-丁二醇的积累。此外,我们的结果表明,最终菌株的氧传递速率和KLa均有所增加,这可能有利于氧供应和ATP生成。本研究证实了ATP供应的增强是提高地衣芽孢杆菌γ-PGA产量的有效策略。


相关研究论文已发表(原文链接)

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1002/bit.26774




欢迎访问迪必尔生物官网, 下载中文版原论文。

www.parallel-bioreactor.com 


湖北大学微生物工程研究室 

历史沿革:

2006年成立微生物工程研究室(华中农业大学)起,重点聚焦聚谷氨酸等发酵产品,逐渐发展地衣芽胞杆菌生物技术,并拓展建立地衣芽胞杆菌发酵工程平台、代谢工程平台和蛋白表达平台。2014年成立湖北大学微生物工程研究室,进一步建立代谢组学平台,科学研究由应用基础、技术开发深入到作用机制。

目前研究室承担包括973、863、国家基金、省市科技项目等6项纵向课题,以及8项横向企事业项目;与多家企业建立校企合作,科技成果转化十余家企业;发表SCI论文39篇,发明专利19项,成果鉴定3项;获得包括国家科学技术进步奖二等奖、湖北省科学技术发明一等奖、国家烟草专卖局科学技术进步奖一等奖等多项奖项。

总体定位:

应用基础:芽胞杆菌生物学问题

应用开发:建立地衣芽胞杆菌代谢工程平台和蛋白表达平台,产业化聚谷氨酸、微生物农药和生物肥料、饲料添加剂、食品添加剂、生物能源等


微生物工程研究室PI-陈守文教授 

基本情况简介:博士,教授,博士生导师,2007年度教育部新世纪优秀人才计划,2015年度国家百千万人才工程人选,国家有突出贡献中青年专家。

主要社会兼职:湖北省科技发展计划农业生产资料技术领域专家组成员(2007-2010),烟草行业烟用植物应用研究重点实验室学术委员会委员(第三届),湖北省烟草专卖局第三/四届科学技术委员会委员,湖北省饲用植物蛋白工程技术中心学术委员会委员,中国农业生物技术学会微生物技术分会常务理事,湖北省生物工程学会理事,湖北省遗传学会理事,《应用与环境生物学报》、《热带生物学报》期刊编委。

主要研究领域:生物化工、农业微生物制剂

 

承担科研项目:

1.瓜类白粉病高效生防制剂——Iturin A芽胞杆菌水剂的创制与应用,武汉市科技局,2016-2017 

2.生物有机肥料功能菌株生产技术研究,鄂西卷烟材料厂,2015-2016 

3. 生态种植土壤微生物区系评价,湖北省烟草研究院,2015-2016 

4.烟草秸秆生物有机肥快速发酵技术研究与应用,湖北省烟草公司恩施州公司,2015-2016

5. 多粘类芽胞杆菌KN-03抗菌物质的分析及发酵工艺优化,武汉科诺生物科技股份有限公司,2015-2016

6. Iturin A 芽胞杆菌制剂创制和产业化,武汉科诺生物科技股份有限公司,2015-2016

7. 外源和土著有益菌向根表趋化成膜和作用机制研究,编号 2015CB150505,973计划,2015-2019 

8. 芽胞杆菌生物技术基础研究,绿康生化股份有限公司,2015年07月至2017年06月

9. 功能微生物二次发酵畜禽养殖废弃物有机肥技术,湖北省科技支撑计划,2014年7月至2016年6月,项目编号2014BBB009 

10. 农用酶制剂高效制备技术, “十二五”农村领域国家科技计划课题(农用微生物制剂和酶制剂产品开发前沿共性技术研究),编号2013AA102801-52,起止年限:2013年1月至2017年12月

11. 聚谷氨酸的中试生产及应用开发(技术转让),武汉光华时代生物科技有限公司,2013.10

12. 聚-γ-谷氨酸作为肥料吸收促进剂在农业种植中的应用(ZL 200610018395.3),专利转让,武汉乐阳生物科技有限公司,2013

13. 聚γ-谷氨酸“从头合成”工程菌株构建及发酵工艺优化,武汉市科技攻关,起止年限:2013年2月至2014年12月,项目编号:2013020602010301

14. 微生物高效合成聚谷氨酸的生产技术及农业应用技术(技术转让),河南远东生物工程有限公司,2012

15. 烟草病害生物防治技术研究,湖北省烟草科研所,起止年限:2011年1月至2014年12月

16. 烟秆生物有机肥的研究与开发,湖北省烟草公司恩施州公司,起止年限:2012年6月至2015年6月

17. 盐胁迫促进地衣芽胞杆菌高效合成聚γ-谷氨酸的代谢机制,国家自然科学基金,项目批准号:31170046,起止年限:2012年1月至2015年12月 

18. 新型生物肥料发酵技术和新剂型的研究,湖北省科技攻关,项目编号2010BBB015,起止年限:2010年11月至2011年12月

19. 华中农大浦城绿康生物工程研究所基金,浦城绿康生化有限公司,起止年限:2011年1月至2015年12月

20. 新型烟草秸秆功能生物有机肥的研制,湖北省烟草科研所,起止年限:2012年7月至2014年12月

21. 农用级聚γ-谷氨酸产业化中试,农业科技成果转化资金,2010GB23600662;起止年限:2010年6月至2012年6

22. 高产Zwittermincin A和晶体蛋白的高毒力苏云金芽胞杆菌突变株D1-23及应用(专利转让),绿康生化股份有限公司,2011年

23. 高效解磷的丁酸梭菌A5-4及应用(ZL 201010153419.2),专利转让,2013

24. 烟草增香提质的生物作用机制与应用,湖北中烟工业有限责任公司;起止年限:2009年1月至2010年12月

25. “聚γ-谷氨酸肥料增效剂的中试与示范”,子课题, 农业科技成果转化资金,起止年限:2009年6月至2011年6月,项目编号2009GB2G410427

26. 新型高效复合肥产业化开发,湖北省科技攻关重大专项,ZND0017;起止年限:2008年1月至2010年12月

27. 烟草秸秆生物有机肥腐熟剂的功能菌株选育及发酵技术,湖北省烟草科研所,起止年限:2010年11月至2011年12月

28. 猪链球菌和副猪嗜血杆菌培养条件和培养基的优化,十一五国家支撑计划“细菌性疫苗高密度培养技术研究与示范”子课题,起止年限:2009年7月至2011年12月, 项目编号:2009BADB4B03

29. 新型肥料增效剂——聚γ-谷氨酸的研究与产业开发, (2007年度),教育部新世纪人才支持计划,编号:NCET-07-0341,起止年限:2008年1月至2010年12月

30. 聚γ-谷氨酸技术产业化联合开发,河北维尔康制药有限公司,起止年限:2007年12月至2012年12月

31. 杆菌肽发酵生产技术,福建浦城绿康生化有限公司攻关课题,起止年限:2007年6月至2010年6月

32. 工业酒精酵母的代谢分析,国家863目标导向课题“新型重组工业酿酒酵母的构建及其高强度和高密度酒精发酵”子课题,编号2007AA10Z359;起止年限:2007年10月至2010年12月

33. 新型生物肥料的研究与开发,湖北省科技攻关重点课题,编号:2006AA201B33;起止年限:2006年1月至2007年12月

34. 聚γ-谷氨酸在水稻栽培中的应用,2007年,十一五国家支撑计划“长江中游(湖北)单双季稻丰产高效技术集成与示范”子课题

35. 生物产香技术制备特色香原料的研究,武汉烟草(集团)有限公司;起止年限:2007年10月至2009年10月

36. 苏云金芽胞杆菌杀虫剂微胶囊剂的研究与产业化开发,湖北省科技攻关重大专项(现代生物农药研究与产业化开发)子课题,编号:2006AA205A01;起止年限:2006年1月至2008年12月

37. 聚γ-谷氨酸及其增效肥在烟草上的应用,湖北省烟草科研所,鄂烟科[2006] 7号;起止年限:2006年1月至2009年12月。

38. 聚-γ-谷氨酸的发酵生产与应用开发的中试研究,湖北省科技攻关课题,编号:2005AA401C13;起止年限:2005-2006

39. 乳酸链球菌素的高产菌株选育和发酵工艺研究,企业横向课题;起止年限:2005年9月至2006年9月,

40. 苏云金芽胞杆菌杀虫剂发酵新技术和新剂型,国家“十五”攻关课题;编号:2004BA713B02-02;起止年限:2004年1月至2005年12月

41. 苏云金芽胞杆菌杀虫剂发酵新技术和新剂型,国家“十五”攻关课题;编号:2001BA713B02-02;起止年限:2001年1月至2003年12月。

42. 苏云金芽胞杆菌合成苏云金素的代谢网络分析,工业生物技术教育部重点实验室开放课题;起止年限:2004年6月至2006年6月,

43. 拟除虫菊酯中间体的酶法拆分,湖北省自然基金;编号: 996051;起止年限:1999年1月至2001年12月 

44. 拟除虫菊酯中间体的酶法拆分,华中农业大学校级创新课题;编号:998020;起止年限:1999年1月至2000年12月

 

代表性SCI/EI论文(通讯作者文章):

1. Wu B, Wang X, Yang L, Yang H, Zeng H, Qiu Y, Wang C, Yu J, Li J, Xu D, He Z*, Chen S*, 2016, Effects of Bacillus amyloliquefaciens ZM9 on bacterial wilt and rhizosphere microbial communities of tobacco,Applied Soil Ecology,103:1-12,(Co-Correspondence) 

2. Cai D, Wei X, Qiu Y, Chen Y, Chen J, Wen Z, Chen S*, 2016, High-level Expression of nattokinase in Bacillus licheniformis by manipulating signal peptide and signal peptidase, J. Appl Microbiol, (online) (Correspondence)

3. Qiu Y, Zhang J, Li L, Wen Z, Nomura CT, Wu S*, Chen S*, 2016, Engineering Bacillus licheniformis for the production of meso-2,3-butanediol, Biotechnol. Biofeul,9:117 (Co-Correspondence)

4. Wang J, Yuan H, Wei X, Chen J, Chen S*, 2016,Enhancement of poly-γ-glutamic acid production by alkaline pH stress treatment in Bacillus licheniformis WX-02, J. Chem. Technol. Biotechnol (online) (Correspondence)

5. Liang C, Huo Y, Qi G, Wei X, Wang Q, Chen S*, 2015, Enhancement of L-valine production in Bacillus licheniformis by blocking three branched pathways, Biotechnol. Lett. 37(6); 1243-1248 (Correspondence)

6. Guo J, Cheng G, Gou X, Xing F, Li S, Han Y, Wang L, Song J, Shu C, Chen S*, Chen L*. 2015, Comprehensive transcriptome and improved genome annotation of Bacillus licheniformis WX-02, FEBS Lett, 589(18):2372-81.  (Co-Correspondence)

7. Wei X, Zhou Y, Chen J, Cai D, Wang D, Qi G, Chen S*, 2015, Efficient expression of nattokinase in Bacillus licheniformis: host strain construction and signal peptide optimization, J Ind. Microbiol. Biotechnol., . 42:287-295,(Correspondence)

8. Wei X, Tian G; Ji Z,Chen S*, 2015, A new strategy for enhancement of poly-γ-glutamic acid by multiple physicochemical stresses in Bacillus licheniformis, J. Chem. Technol. Biotechnol. 90:709-713 (Correspondence)

9. Yuan H, Wei X, Zeng Z, Yang D, Chen S*, 2014, Poly-γ-glutamic acid modified magnetic nanoparticles for fast solid phase extraction of trace amounts of Cu (II) and Pb (II), Analytical Methods,  6,9800–9806  (Correspondence) 

10. Wei X, Deng X, Ji Z, Wang C,Yu J, Li J, Chen S*, 2014,Decreased Tobacco-specific Nitrosamines by Microbial Treatment with Bacillus amyloliquefaciens DA9 during Air-curing Process of Burley Tobacco, J. Agri. Food Chem., 62 (52):12701–12706,(Correspondence)

11. Qi G, Kang Y, Li L, Xiao A, Zhang S, Wen Z, Xu D, Chen S*, 2014, Deletion of meso-2,3-butanediol Dehydrogenase Gene budC for Enhanced D-2, 3- butanediol Production in Bacillus licheniformis, Biotechnol. Biofeul, 7:16 . doi: 10.1186/1754-6834-7-16. (Correspondence) 

12. Li X, Gou X, Long D, Ji Z, Hu L, Xu D, Liu J, Chen S*,2014,Physiological and Metabolic Analysis of Nitrate Reduction on Poly-gamma-Glutamic Acid Synthesis in Bacillus licheniformis WX-02, Arch Microb. 196(11):791-799. (Correspondence) 

13. Qiu Y., Xiao F., Wei X, Wen Z. Chen S*., 2014,Improvement of lichenysin production in Bacillus licheniformis by replacement of native promoter of lichenysin gene cluster, Appl. Microb. Biotechnol. 98(21):8895-903. (Correspondence) 

14. Tian G, Fu J, Wei X, Ji, Z,  Ma X,  Qi G,  Chen S*, 2014, Enhanced expression of  pgdS gene for high production of poly-γ-glutamic aicd with lower molecular weight in Bacillus licheniformis WX-02, J. Chem. Technol. Biotechnol  89:1825-1832 (Correspondence)

15. Li X, Long D, Ji J, Yang W, Zeng Z, Guo S, Ji Z, Qi G, Chen S*, 2013, Sample preparation for the metabolomics investigation of poly-gamma-glutamate-producing Bacillus licheniformis by GC-MS, J Microbiol Method, 94:61-67 (Correspondence)

16. Zhou J, Xu Z, Chen S*, 2013, Simulation and prediction of the thuringiensin abiotic degradation processes in aqueous solution by a radius basis function neural network model, Chemosphere, 91:442-447 (Correspondence)

17. Yang W, Zhou Y, Lei Y, Qiu Y, Wei X, Ji Z, Qi G, Yong Y, Chen L, Chen S*,2012, Genome Sequence of Bacillus licheniformis WX-02, J. Bacteriol. 194(13):3561-3562  (Correspondence)

18. Yao D, Ji Z, Wang C, Qi G, Zhang Z, Ma X, Chen S*, 2012, Co-producing iturin A and poly-γ-glutamic acid from rapeseed meal under solid state fermentation by the newly isolated Bacillus subtilis strain 3-10, World J Microbiol Biotechnol, 28:985-991 (Correspondence) 

19. Jiang F, Qi G, Ji Z, Zhang S, Liu J, Ma X, Chen S*, 2011. Expression of glr gene encoding glutamate racemase in Bacillus licheniformis WX-02 and its regulatory effects on synthesis of poly-γ-glutamic acid. Biotechnol Lett, 33(9):1837-40 (Correspondence)

20. Liu Y, Zhang S, Yong Y, Ji Z, Ma X, Xu Z, Chen S*, 2011,Efficient production of acetoin by the newly isolated Bacillus licheniformis strain MEL09, Process Biochem., 46:390-394  (Correspondence)

21. Wei X, Ji Z, Chen S*, 2010, Isolation of halotolerant Bacillus licheniformis WX-02 and regulatory effects of sodium chloride on yield and molecular sizes of poly-γ-glutamic acid, Appl. Biochem. Biotechnol., 160: 1332-1340 (Correspondence)

22. Zhang X, Liang Z, Siddiqui Z, Gong Y, Yu Z, Chen S*, 2009, Efficient screening and breeding of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki for high toxicity against Spodoptera exigua and Heliothis armigera , J Ind. Microbiol. Biotechnol., 36:815-820. (Correspondence)

23. Zhou J, Chang Y, Xu Z, Yu Z, Chen S*, 2007, Production of thuringiensin by fed-batch culture of Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis 032 with an improved pH-control glucose feeding strategy,Process Biochem., 42(1), 52-56. (Correspondence) 

24. Xu J, Chen S*, Yu Z,2005, Optimization of process parameters for poly γ-glutamate production under solid state fermentation from Bacillus subtilis CCTCC202048,Process Biochem., 40:3075-3081. (Correspondence) 

 

授权发明专利(第一发明人):

1. 陈守文,喻子牛,江昊,孙明,何进,蔡皓,李林,2003,聚-γ-谷氨酸产生菌及生产聚-γ-谷氨酸的方法,发明专利号ZL 03118908.3。(2005年12月14号)

2. 陈守文,喻子牛,陈雄,蔡皓,柯云,孙明,何进,聚-γ-谷氨酸作为肥料吸收促进剂在农业种植中的应用,发明专利号ZL 200610018395.3。(2008年授权)

3. 陈守文,喻子牛,张小朋,冀志霞, 蔡皓,孙明,高产Zwittermincin A和晶体蛋白的高毒力苏云金芽胞杆菌突变株D1-23及应用,发明专利号ZL 200610124933.7。

4. 陈守文,鲁伟,岳传静,2006,一种用植物饼粕为原料生产乳酸链球菌素的工艺,发明专利号ZL 200610019565.X。(2009年授权)

5. 陈守文,蔡皓,舒芹,柯云,冀志霞,钱风光,聚-γ-谷氨酸增效肥料, 发明专利号ZL 200710052667.6。(2010年授权)

6. 陈守文,郭志伟,李滔,一种乳链菌肽基因工程菌MELgad的构建方法,发明专利号ZL 200710052388.x。(2010年授权)

7. 陈守文,王昌军,蔡皓,李进平,童康琼,舒芹,柯云,王晓丽,冀志霞,祖秉桥,杨树,聚-γ-谷氨酸在白肋烟大田生产中的应用,发明专利号ZL200810046777.6(2011年授权)

8. 陈守文,谢萍,魏雪团,刘晓雷,冀志霞,郭威,张红艳,孙君伟,李海涛,李建波,米造吉,黄品奇,王正品,一种地衣芽胞杆菌菌株及用途和用其生产聚-γ-谷氨酸的方法,发明专利号 ZL 200810055068.4(2010年11月10日授权)

9. 陈守文,冀志霞,周光林,马昕,信建, 高效解磷的丁酸梭菌A5-4及应用,发明专利号:ZL 201010153419.2.(2011年授权)

10.陈守文,魏雪团,冀志霞,雍阳春,舒芹,利用环境压力提高芽胞杆菌发酵聚-γ-谷氨酸产量的方法, 发明专利号ZL 200910272770.0(2012年11月21日授权)

11.陈守文,冀志霞,姚德惠,马昕,祁高富,邓有辉.一种生产多功能生物有机肥的方法及其应用,发明专利号:ZL 201110125278.8  (2013年03月13日授权)

12.陈守文,王昌军,信建,马昕,冀志霞,李进平,祁高富,祖秉桥, 杨树,紫云英根瘤菌高密度发酵工艺,发明专利号ZL 201110047474.8(2013授权)

13.陈守文,王昌军,信建,冀志霞,李进平,祖秉桥,祁高富,马昕, 杨树,解磷恶臭假单胞菌L13及其发酵工艺,发明专利号ZL 201110047420.1(2013年09月1日授权)

14.陈守文,冀志霞,孙政,李丹,吴凤光,李琳;一株降低烤烟烟叶亚硝胺的恶臭假单胞菌T2-2及用途,发明专利号:ZL 201110090798.X(2013年授权)

15.陈守文,刘洋,冀志霞,韦杰,李丹,吴风光,何结望,李琳, 一种高地芽胞杆菌及其在烤烟上部烟叶人工陈化中的应用, 发明专利号ZL 201110057928X(2014年授权)

16.陈守文,冀志霞,王洋波,柯云,雍阳春,γ-聚谷氨酸或其盐作为添加剂在乳制品中的应用, 发明专利号:ZL 200910272421.9。(2014年01月08日授权)

17.陈守文,冀志霞,石娜娜,祁高富,马昕;一种戊糖片球菌高密度发酵培养基及发酵方法,中国发明专利号:ZL 201210233896.9(2014年授权)

18.陈守文,邓有辉,舒芹,马昕,冀志霞;一种复合微生物肥料及其制备方法,中国发明专利号:ZL 201210105105.4(2015年2月04日授权)

19.陈守文,呙亚屏,王瑞,冀志霞,杨亮,秦兴成,伍良伟,徐迪红,施河丽,一种烟碱降解菌及其应用,发明专利号ZL201310616712(2015年授权)

20.陈守文,祁高富,罗文,李俊辉,楼丽君,一种携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌菌株及其构建方法与应用,发明专利号ZL 201410063546(2016.04.13授权)

 

获奖情况:

1.微生物农药发酵新技术新工艺及重要产品规模应用,国家科学技术进步奖二等奖,2006-J-201-2-14-R02,2006年,朱昌雄,陈守文,宋渊,于毅,关雄,蒋细良,刘红彦,杨自文,朴春树,李季伦

2.聚γ-谷氨酸发酵生产关键技术及农业应用,湖北省科技发明一等奖,2014,陈守文,喻子牛,王昌军,张似松,汤三洲,李俊辉

3.聚γ-谷氨酸及其增效肥在烟草上的应用,湖北省烟草公司科学技术进步奖二等奖, 2010,陈守文,王昌军,李进平,祖秉桥,柯云,杨树,梁立军,喻子牛,童康琼,杨春雷

4.苏云金芽胞杆菌高毒力基因工程菌WG-001及生产工艺与产品,武汉市科技进步二等奖,2005,排名第四。

5.防鳞翅目和鞘翅目害虫的苏云金芽胞杆菌制剂和研究,珠海市科技进步二等奖,2005,排名第四。

6. 烟草秸秆生物有机肥研制与产业化应用,2015,国家烟草专卖局科学技术进步奖一等奖,杨树,黄树立,谭志平,祖秉桥,王昌军,马昕,等,陈守文(16)

7. 新型高效秸秆腐熟剂及秸秆生物肥料的研制与应用,2015,大北农科技创意奖,陈守文,冀志霞,秦兴成,王金梅,徐迪红,马昕,陈建刚,杨欢

 

迪必尔生物工程(上海)有限公司

迪必尔生物工程(上海)有限公司(T&J公司),国内首家将微小型平行生物反应器成功商业化的研发和制造商。专注于开发更智能、更可靠的微生物培养、细胞培养生物反应器。用极客精神做产品“为发烧而生,为中国质造而生”是T&J的产品概念。致力让全球每个科研人,都能享用来自中国的优质可靠科技产品。




注:本文内容由杨守文团队提供,由迪必尔生物小编整理发布,感谢此资源提供者。如有任何建议或意见等,请您加小编微信(13918007863)交流互动。



关注迪必尔生物

了解最靠谱的生物反应器技术


电话:021-57640001

网址:www.parallel-bioreactor.com

http://www.tjbio.net

http://www.bioreactors.cn 

邮箱:gentle@bioreactors.cn