巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统之所以可以严格控制外源基因的高效表达，是因为其拥有需要甲醇诱导的醇氧化酶 I 基因（AOX1）的诱导型启动子，几乎可以满足众多外源蛋白的简单发酵操作[1，3]。重组毕赤酵母的表达培养分为两个阶段,首先让重组毕赤酵母先在甘油的培养基中生长达到一定的细胞密度，再加入甲醇，启动蛋白的表达[2，4]。
在实际发酵过程中，往往需要人员的长时间的值守来进行补料切换，才能在合适的时间进行产物的诱导表达。为避免这一现象，现采用迪必尔生物工程的Interlli-Ferm mini 5L生物反应器，基于D2MS（设备和数据管理系统, Device & Data management system）的APC（高级功能过程控制，Advanced process control）实现毕赤酵母表达蛋白的自动化控制。
经试验结果显示， APC功能可以设置不同的触发条件，不同的补料策略来源，对多个补料泵进行准确时间点的自动化补料控制。并且在APC自动补料控制的条件下， 筛选出最优BSM培养基，该培养基经过甲醇诱导后，在142h时，毕赤酵母表达蛋白量可达到7,955.406mg/L。
实验场所：
迪必尔生物 应用技术与工程研究中心（CARE）
控制系统：
D2MS（设备和数据管理系统, Device & Data management system）
工艺参数条件：
见表2
总蛋白含量测定方法:
利用Bradford 法对发酵上清液进行总蛋白含量测定。做出总蛋白质浓度C为0~200 mg/L 的标准曲线（图2）。得到吸光值与浓度之间的线性关系为：Y=295.74*X，R2=0.9962。
由以上公式可知，样品总蛋白浓度C=295.74*吸光值A595nm*稀释倍数N。
补料策略：
相较于传统的发酵罐补料，我们使用D2MS软件的APC功能，可以避免人员长时间的值守，实现自动化控制。我们可以设置不同的触发条件，不同的补料策略来源，对多个补料泵进行准确时间点的自动化补料控制。
补料思路是：
当第一次DO回升时，进行Feed1补料，且按照时间序列（图3b）进行；
当第二次DO回升时，进行Feed2补料，且按照时间序列（图3c）进行。
整个培养过程
(1)APC自动化
如图4，在开启APC程序后，1号培养基罐和BSM培养基罐可以自动触发Feed1和Feed2的时序补料。由此可见，APC功能可以实现分段补料策略。
（2）DO变化趋势
由图4可知，两种培养基在前期（0-20h）生长速率不一致，1号培养基对应罐体菌体生长缓慢。
由图5可知，在不同的培养阶段，毕赤酵母的发酵液呈现不同的状态.
整个培养过程中发酵液各指标变化
（1）OD值和湿重
由图7和图8所知， 1号培养基对应的OD值最高为404（114.8h），湿重最高为325.3g/L（90.9h）；BSM培养基对应的OD值最高为793（142h），湿重最高为485.7g/L（142h）。
（2）胞外表达总蛋白含量
由表3可知，1号培养基在培养90.9h时，发酵液总蛋白含量达到最高721.606mg/L，BSM培养基在培养142h时，发酵液总蛋白含量达到最高7,955.406mg/L。
1、D2MS软件内的APC功能可以设置不同的触发条件，不同的补料策略来源，对多个补料泵进行准确时间点的自动化补料控制。
2、在APC自动补料控制的条件下，运用该工艺参数时，BSM培养基经过甲醇诱导后，毕赤酵母表达蛋白量优于1号培养基，且在142h时，总蛋白含量可达到7,955.406mg/L。
参考文献
[1]王锦佳.新型重组毕赤酵母中外源蛋白的诱导表达新工艺[D].华东理工大学,2017.
[2]鹿承建.重组毕赤酵母全细胞转化L-乳酸合成丙酮酸钠的工艺研究[D].福建师范大学,2020.DOI:10.27019/d.cnki.gfjsu.2020.001013.
[3]张丽华.重组毕赤酵母中10-HDA的生物合成研究[D].齐鲁工业大学,2021.DOI:10.27278/d.cnki.gsdqc.2021.000451.
[4]赵允章.毕赤酵母（Pichia pastoris）LNF013产纳豆激酶发酵优化及发酵动力学研究[D].辽宁大学,2023.DOI:10.27209/d.cnki.glniu.2023.000840.
