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用T&J-Qtype 平行生物反应器系统生物法发酵生产新型烯二炔类天然产物天赐霉素-A
来源:段燕文教授团队 中南大学湘雅国际转化医学联合研究院 (迪必尔生物编辑部 上海 0180502) | 作者: 朱湘成博士 | 发布时间: 2018-05-25 | 333 次浏览 | 分享到:
建立了串珠镰刀菌真菌遗传系统,并设计和实现了串珠镰刀菌聚酮化合物合成酶的基因突变,从基因工程菌中分离出具有抗疟疾,抗结核及抗真菌活性的新型次生代谢产物并完成其结构鉴定。对雷帕霉素和Iso-migrastatin在链霉菌宿主中的异源合成进行了研究。目前主要从事合成生物学和组合生物合成研究,研究放线菌类天然产物(如聚酮化合物)的生物合成和调控机理,探索其工业化应用前景。已在国际期刊上发表SCI论文30余篇。

段燕文教授团队 中南大学湘雅国际转化医学联合研究院

(迪必尔生物编辑部 上海 0180502)



第一部分 应用摘要(前言)
分 应用摘要(前言)

    烯二炔类天然产物具有独特的分子结构和超强的的生物活性,是最具开发前景的一类抗肿瘤抗生素。烯二炔类抗肿瘤抗生素的生物活性主要依赖于其诱导的DNA损伤机制,即通过电子重排形成暂时性苯环双自由基,对DNA小沟进行亲核攻击后形成以脱氧核糖核酸碳链为中心的自由基,并在分子氧的作用下引起单链或双链DNA的断裂。作为迄今为止发现的细胞毒性最强的一类分子,烯二炔类天然产物可作为抗肿瘤抗体偶联药物(ADC)的弹头分子,具有极高的成药前景。目前发现的13种烯二炔分子中,NCSCALozogamicin已被开发成为临床药物,其中由日本开发的SMANCS(聚苯乙烯马来酸共轭NCS)主要用于治疗肝癌,而美国辉瑞公司最近开发的ADC药物MylotargCD33单克隆抗体偶联CAL)和BesponsaCD22抗体inotuzumab偶联ozogamicin)则分别用于治疗急性骨髓性白血病和成人复发或难治性B细胞前体急性淋性白血病。

天赐霉素-ATiancimycin-A,英文简字TNM-A)是2016年通过基因组挖掘技术从链霉菌Streptomyces spCB03234的发酵产物中分离发现的一种新型十元环烯二炔抗肿瘤抗生素,对多种恶性肿瘤细胞有超高的活性,超过目前临床一线化疗药物丝裂霉素近千倍,并且表现出更快速和更完整的肿瘤细胞杀伤力,将是抗肿瘤ADC药物理想的弹头药物分子。由于TNM-A在原始菌株Streptomyces sp. CB03234中的产量极低,而目前达到工业化制备水平的其它烯二炔类天然产物的产量均在20 mg/L以上,现有分子的来源远远不能满足临床研究和工业化生产的应用需求。此外,TNM-A因其复杂独特的分子结构,无法通过传统的化学合成方法来获取,通过微生物发酵是目前制备TNM-A最切实可行的手段。因此,构建稳定的TNM-A高产菌株,可以大幅提高其产量从而有效地解决现阶段TNM-A的发展瓶颈,从而加速推动TNM-A后继的抗癌活性分析、作用机理等临床前期研究以及抗肿瘤ADC新药的开发。

通过对原始生产菌株Streptomyces spCB03234菌株进行基于链霉素抗性的核糖体工程菌种诱变,获得一株TNM-A的高产菌株CB03234-S(保藏号为CCTCC M 2017538),其TNM-A发酵产率达到7 mg/L左右。随后对CB03234-S进行发酵培养基的单因素及复合优化,使其产量得到大幅提高;并在此基础上,在T&J-Qtype 3L六联罐T&J-Dtype 30L发酵罐中,通过对溶氧、pH值控制及原料流加补充等调控手段建立放大规模的TNM-A微生物发酵制备工艺,在缩短发酵周期的前提下,进一步提高TNM-A的发酵产率使其超过30 mg/L,可满足现有工业中试化生产的需求。

第二部分 实验目的与方法第二部分  实验目的与方法

     目的:新型烯二炔类天然产物天赐霉素-A发酵工艺建立及其产量提升

     方法:首先在T&J-Qtype 3L六联罐上进行溶氧条件、pH条件及接种条件进行摸索,得到发酵罐中的最佳发酵条件,并在30L发酵罐中进行发酵验证,使其达到中试化目的。

 




第三部分 结果与分析

天赐霉素-ATiancimycin-A,英文简字TNM-A)是一种新型十元环烯二炔抗肿瘤抗生素,对多种恶性肿瘤细胞有超高的活性,超过目前临床一线化疗药物丝裂霉素近千倍,并且表现出更快速和更完整的肿瘤细胞杀伤力,将是抗肿瘤ADC药物理想的弹头药物分子。由于TNM-A在原始菌株Streptomyces sp. CB03234中的产量极低,仅为0.5 mg/L左右,而目前达到工业化制备水平的其它烯二炔类天然产物的产量均在20 mg/L以上,现有分子的来源远远不能满足临床研究和工业化生产的应用需求。因此,构建稳定的TNM-A高产菌株,可以大幅提高其产量从而有效地解决现阶段TNM-A的发展瓶颈,从而加速推动TNM-A后继的抗癌活性分析、作用机理等临床前期研究以及抗肿瘤ADC新药的开发。

通过T&J-Qtype 3L六联罐上控制发酵过程中的条件变化,产量进一步提升。

具体如下:

首先控制在控制其他条件(联动、转速100-250rpm,通气量5sL/min,罐压0.02MPa)不变的条件下,一:探究溶氧对产量的影响,设置不同区间的溶氧发酵,得到最佳溶氧条件;二:探究补料条件对产量的影响,通过发酵后期不同补料条件,控制pH值的变化,得到最佳补料条件得;三:探究接种量对产量影响,得到最佳接种条件。

通过对现有条件发酵工艺的优化,使TNM-A产量超过30 mg/L,达到工业化制备要求,相关成果已申请专利。

中南大学“湘雅国际转化医学联合研究院

 中南大学湘雅国际转化医学联合研究院研究员、博导,组合生物合成与天然产物药物湖南省工程研究中心研究员,微生物实验室主任。

  建立了串珠镰刀菌真菌遗传系统,并设计和实现了串珠镰刀菌聚酮化合物合成酶的基因突变,从基因工程菌中分离出具有抗疟疾,抗结核及抗真菌活性的新型次生代谢产物并完成其结构鉴定。对雷帕霉素和Iso-migrastatin在链霉菌宿主中的异源合成进行了研究。目前主要从事合成生物学和组合生物合成研究,研究放线菌类天然产物(如聚酮化合物)的生物合成和调控机理,探索其工业化应用前景。已在国际期刊上发表SCI论文30余篇。


朱湘成 博士

   中南大学湘雅国际转化医学联合研究院研究员、博导,组合生物合成与天然产物药物湖南省工程研究中心研究员,微生物实验室主任。

  建立了串珠镰刀菌真菌遗传系统,并设计和实现了串珠镰刀菌聚酮化合物合成酶的基因突变,从基因工程菌中分离出具有抗疟疾,抗结核及抗真菌活性的新型次生代谢产物并完成其结构鉴定。对雷帕霉素和Iso-migrastatin在链霉菌宿主中的异源合成进行了研究。目前主要从事合成生物学和组合生物合成研究,研究放线菌类天然产物(如聚酮化合物)的生物合成和调控机理,探索其工业化应用前景。已在国际期刊上发表SCI论文30余篇。

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        迪必尔生物工程(上海)有限公司(T&J公司),国内首家将微小型平行生物反应器成功商业化的研发和制造商。专注于开发更智能、更可靠的微生物培养、细胞培养生物反应器。用极客精神做产品“为发烧而生,为中国质造而生”是T&J的产品概念。致力让全球每个科研人,都能享用来自中国的优质可靠科技产品。



注:本文内容由朱湘成博士课题组提供,由迪必尔生物小编整理发布,感谢此资源提供者。如有任何建议或意见等,请您加小编微信(13918007863)交流互动。



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