在细胞基质流感疫苗应用领域，MDCK细胞是最常用的哺乳动物细胞系之一[1]。由于贴壁细胞的培养工艺难以放大至商业化规模，并且使用载体会额外增加成本，因此对贴壁细胞进行悬浮驯化及悬浮后的工艺开发目前已经成为热点[2]。本文主要通过迪必尔生物 Opti-Cell mini（3L）生物反应器建立MDCK细胞无血清全悬浮培养工艺，为流感疫苗的高效及低成本生产提供数据基础。
在细胞基质流感疫苗应用领域，MDCK细胞是最常用的哺乳动物细胞系之一[1]。由于贴壁细胞的培养工艺难以放大至商业化规模，并且使用载体会额外增加成本，因此对贴壁细胞进行悬浮驯化及悬浮后的工艺开发目前已经成为热点[2]。本文主要通过迪必尔生物 Opti-Cell mini（3L）生物反应器建立MDCK细胞无血清全悬浮培养工艺，为流感疫苗的高效及低成本生产提供数据基础。
使用迪必尔生物 Opti-Cell mini（3L）生物反应器（图1）进行MDCK细胞的培养。在初始1 L工作体积下，MDCK细胞接种密度为5.23×105 cells/mL，本次实验工艺参数设置如表1所示。DO由氧气的通气速率级联控制，空气恒通0.008 vvm（8 mL/min）。当原体系的pH值自然降低到设定值时开启pH自动控制，由二氧化碳的通气速率和碱液（0.5M NaOH）的流加速率级联控制。其中，进气模式均为底部通气。在整个培养周期中，各参数控制均可靠且稳定（图2）。
图1 Opti-Cell mini（3L）生物反应器
Day 0~Day 5细胞密度变化如图3所示，最高活细胞密度（VCD）为4.86×106 cells/mL。葡萄糖和乳酸浓度变化如图4所示，每24 h葡萄糖消耗量和乳酸积累量变化如图5所示。随着细胞的生长增殖，代谢产生大量乳酸，为维持pH值的恒定流加了大量碱液，导致体系渗透压偏高，这也是后期细胞活率降低的原因之一。由于MDCK悬浮细胞株为贴壁细胞株经悬浮驯化而来，悬浮培养条件下仍会出现细胞黏附聚团现象。由每天取样镜检图像（图6）可见，从Day 2开始出现明显细胞结团现象，且后期细胞团块直径逐渐变大，这与细胞活率降低也有一定关系，提示需要加入抗结团剂保证单个细胞的均匀悬浮分散。本批次实验主要目的为验证3L反应器控制性能及稳定性，后期经工艺优化后细胞密度仍有提升空间。
针对细胞基质流感疫苗的研发与生产，无血清全悬浮培养工艺的开发已成为研究重点。迪必尔生物 Opti-Cell mini生物反应器（图7）应用灵活，适用于各种贴壁及悬浮哺乳动物细胞培养工艺的开发与优化，支持批次、补料、灌流等多种培养工艺，搭载D²MS实现参数稳定控制及高扩展性应用，助力生物制品的工艺验证与放大。
图7 迪必尔生物Opti-Cell mini生物反应器
[1] V. Lohr, Y. Genzel, I. Behrendt, K. Scharfenberg, U. Reichl, A new MDCK suspension line cultivated in a fully defined medium in stirred-tank and wave bioreactor. Vaccine. 2010, 28(38): 6256-6264.
[2] Wu, Y., Bissinger, T., Genzel, Y. et al. High cell density perfusion process for high yield of influenza A virus production using MDCK suspension cells. Applied Microbiology and Biotechnology. 2021, 105, 1421–1434.
