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用T&J-Ctype 原位灭菌发酵罐生物法发酵生产新型博来霉素衍生物天赐博星(6′-脱羟基-BLM Z)
来源:段燕文教授团队 中南大学湘雅国际转化医学联合研究院 (迪必尔生物编辑部 上海 0180502) | 作者: 朱湘成 博士 迪必尔生物 | 发布时间: 2018-05-20 | 510 次浏览 | 分享到:
6′-脱羟基-BLM Z 在黄绿链霉菌重组工程菌SB9026中的发酵产率极低,产量仅为5 mg/L左右,要推动其后继的抗癌活性分析、作用机理等临床前期以及新药开发研究,就必需获得足量的6′-脱羟基-BLM Z 。因此,开发稳定有效的6′-脱羟基-BLM Z发酵工艺对于其产量提升和规模化制备都是必须的。

段燕文教授团队 中南大学湘雅国际转化医学联合研究院

(迪必尔生物编辑部 上海 0180502)

 

第一章 应用摘要(前言)

 

博莱霉素(Bleomycin,英文简字BLM)是20世纪60年代从轮枝链霉菌(Streptomyces verticillus)的发酵产物中分离发现的一类糖肽类抗肿瘤抗生素。目前已有十余种博莱霉素天然组分被发现,它们的结构仅在末端胺基上存在差异,其中主要成分为博莱霉素 A2(55%~70%)和博莱霉素 B2(25%~32%)。

博莱霉素有独特的分子结构和生物活性,能够介导激活氧分子,并选择性地引起单链和双链DNA的断裂从而抑制肿瘤细胞DNA合成和复制。此外,博莱霉素还可以选择性地裂解RNA从而抑制蛋白质的合成。博莱霉素的活性机理决定了其不会抑制骨髓造血系统和免疫系统,因此对人体白细胞,机体免疫功能和造血系统等的副作用较为轻微。博莱霉素属于细胞周期非特异性药物,从上世纪80年代起被开发成为一种重要的有效抗肿瘤药物,在临床上广泛应用。以BLM A2和B2为主要成分的商品药Blenoxane®就被用于治疗睾丸癌,同时还广泛应用于霍奇金淋巴瘤、鳞状上皮细胞癌、生殖细胞瘤和其他肿瘤的治疗。但是博莱霉素能增加活性氧分子从而导致细胞的氧化压力,并诱导肺中的上皮和非上皮细胞的衰老和凋亡最终导致肺纤维化。因此博莱霉素导致的剂量依赖性肺纤维化以及一些肿瘤细胞逐渐形成的耐药性极大地限制了其临床应用和推广。获得新型的高效低毒的博莱霉素族衍生物一直都是开发博莱霉素类抗肿瘤药物的重点。

博莱霉素复杂的分子结构使得通过传统的化学全合成方法来获取其相关衍生物的过程及其繁琐且效率低下,无法满足临床研究的需要和工业化生产的应用,并且合成的博莱霉素衍生物也并未展示出更好的活性或更低的毒性。新兴的组合生物合成方法通过遗传操纵次代谢产物生物合成基因来获取目标天然产物衍生物,是一种非常有应用前景的高新技术。从佐伯霉素的原始高产菌株黄绿链霉菌SB9001出发,应用基因重组技术将黄绿链霉菌SB9001中的zbmVIII基因完全失活后得到不生产佐伯霉素的黄绿链霉菌突变株,然后以该突变株作为异源宿主,将包含完整博莱霉素生物合成基因簇(blm基因簇)的人造细菌染色体质粒blm1-6E转入其中获得黄绿链霉菌重组工程菌SB9026(保藏号 CCTCC M 2011292)。从该重组工程菌的发酵培养产物中我们成功得到一种新型博莱霉素衍生物6-脱羟基-BLM Z(天赐博星),并且初步生物活性测试表明6-脱羟基-BLM Z 的DNA裂解活性至少是BLM A2的10倍以上。这说明在更少用量的条件下,6-脱羟基-BLM Z 比目前临床使用的任何一种博莱霉素类抗癌药物的毒性都要低,因此作为迄今为止发现的最有效的博莱霉素衍生物,6-脱羟基-BLM Z 很有希望成为博莱霉素族化合物中的新型抗癌药物。

但是,6-脱羟基-BLM Z 在黄绿链霉菌重组工程菌SB9026中的发酵产率极低,产量仅为5 mg/L左右,要推动其后继的抗癌活性分析、作用机理等临床前期以及新药开发研究,就必需获得足量的6-脱羟基-BLM Z 。因此,开发稳定有效的6-脱羟基-BLM Z发酵工艺对于其产量提升和规模化制备都是必须的。


第二章 实验目的与方法

 

目的:基于前期筛选的6′-脱羟基-BLM Z 高产菌株在T&J-Ctype 15L*2不锈钢原位灭菌发酵罐上进行发酵工艺条件的摸索及优化,建立放大规模的6′-脱羟基-BLM Z的微生物发酵制备工艺。

方法:对发酵罐的温度、转速、pH值控制及原料补充等进行系统调控,研究这些发酵参数对菌种的生长和6′-脱羟基-BLM Z产量的影响。

作为迄今为止发现的最有效的博莱霉素衍生物,6’-脱羟基-BLM Z很有希望成为博莱霉素族化合物中的新型抗癌药物。6’-脱羟基-BLM Z在黄绿链霉菌重组工程菌SB9026中的发酵产率极低,为5 mg/L左右。

通过单一菌落分离和菌种选育筛选出稳定高产的SB9026发酵用菌株。通过T&J-Ctype 15L不锈钢原位灭菌发酵罐上控制发酵过程中的条件变化,产量进一步提升。具体如下:



    首先控制在控制其他条件(联动、转速100-800rpm,通气量30sL/min,罐压0.03MPa)不变的条件下,一:探究溶氧对产量的影响,设置不同区间的溶氧发酵,得到最佳溶氧条件;二:探究补料条件对产量的影响,通过发酵后期不同补料条件,控制pH值的变化,得到最佳补料条件得;三:探究接种量对产量影响,得到最佳接种条件;四:探究温度对产量影响,通过设置不同的温度,得到最佳温度条件;通过对现有条件发酵工艺的优化,使6’-脱羟基-BLM Z产量超过70 mg/L,达到工业化制备要求。

第三章 结果与分析

 

通过T&J-Ctype 15L不锈钢原位灭菌发酵罐6’-脱羟基-BLM Z进行发酵工艺优化,达到工业化制备目的。15L不锈钢原位灭菌发酵罐能够很好地控制条件变化,完成发酵工艺优化的目的。


 更多过程控制策略和数据分析结果可以阅读原论文。

相关论文已发表:

Zhu X, Kong J, Yang H, et al. Strain improvement by combined UV mutagenesis and ribosome engineering and subsequent fermentation optimization for enhanced 6'-deoxy-bleomycin Z production [J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2018, 102(4):1651-1661.


欢迎访问迪必尔生物官网, 下载原论文。

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中南大学
湘雅国际转化医学联合研究院

      前身为中南大学湘雅转化医学研究中心,是我国最早成立的转化医学研究中心之一,并于2012年升级成中南大学湘雅国际转化医学联合研究院.  

    引进和组建了以10名千人计划专家为核心的科研团队,在构建分子库和临床资源库、药物靶标发现与确认、生物医学信息、临床转化医学等领域集聚了一批世界一流科学家,形成了一批原创性成果。成功地利用基因组和蛋白质组研究手段,发现并证实了多个新的药物靶点;多项研究成果成功地进入人体临床医学试验;建立了中国最大放线菌菌种资源库,并运用组合生物合成技术扩展了最有成药特色的天然产物分子库,运用异源表达技术规模化生产这些药物先导物, 为解决制约天然药物产业化的瓶颈技术问题做出一系列开创性工作;目前有7个1.1类靶向抗癌新药处于临床研究前不同阶段,建立了我国转化医学创新体系,各项关键技术处于国际领先水平。

 

 

朱湘成 博士

     朱湘成,男,博士,中南大学湘雅国际转化医学联合研究院研究员

围绕放线菌资源的收集及开发,微生物天然产物的发现和生物合成及其工业化应用等方面展开研究。成功地建立了串珠镰刀菌真菌遗传系统,首次实现了真菌系统中聚酮化合物合成酶(PKS)的组合生物合成,并成功获得具有抗疟疾、抗结核及抗真菌等多种活性的新型天然产物,对真菌聚酮化合物的生物合成具有重要指导意义;通过代谢工程和基因工程进行重要天然产物的工业菌种改良,大幅提高雷帕霉素产量,此外还通过系统性的发酵优化和异源合成将多个重要天然产物的产量大幅提高。目前主要通过收集我国特有生态环境的放线菌资源,基于临床耐药菌从中大力开发活性天然产物资源,同时以烯二炔类和博莱霉素类天然产物为目标,在合成生物学指导下进行基础和应用研究,开发新一代微生物天然产物抗癌药物。已在国际期刊上发表SCI论文40余篇,申请中国发明专利4项。


 

关于迪必尔生物

  迪必尔生物工程(上海)有限公司(T&J公司),国内首家将微小型平行生物反应器成功商业化的研发和制造商。专注于开发更智能、更可靠的微生物培养、细胞培养生物反应器。用极客精神做产品“为发烧而生,为中国质造而生”是T&J的产品概念。致力让全球每个科研人,都能享用来自中国的优质可靠科技产品。


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注:本文由朱湘成博士课题组提供,迪必尔生物小编整理发布

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