杆状病毒表达载体系统（Baculovirus expression vector system，BEVS）是一种利用杆状病毒作为基因载体的系统，通过替换病毒中的非必需基因来实现外源基因的扩增和蛋白表达。具有安全性高、重组蛋白表达水平高、能同时表达多个基因以及易于大规模生产等优势，被广泛应用于预防性及治疗性疫苗和基因治疗药物的研发及生产[1] [2]。
SF9细胞系源自草地贪夜蛾SF21细胞系的克隆分离物[3]，是用于杆状病毒表达的常见细胞系[4]。
本实验采用SF9悬浮细胞在CloudReady™ 500mL云平台平行生物反应器系统上进行了批次（Batch）培养，最终活细胞密度（Viable cell density，VCD）达到1.20×107 cells/mL，活率（Viability）维持在95%以上。验证了CloudReady™能够用于SF9悬浮细胞培养，其稳定、智能的参数控制可以满足SF9悬浮细胞在各个工艺上的条件优化，详见下文。
图1 CloudReady™ 500mL云平台平行生物反应器系统
昆虫细胞系最重要的挑战之一是剪切敏感性，因相对较大且缺乏细胞壁而非常脆弱[5]，因此本次实验选择了两种转速条件培养SF9细胞（以R1、R2表示），并以1×106cells/mL的细胞密度接种。因二氧化碳浓度过高（＞37mmHg）会抑制细胞生长[6]，本次实验不通入CO²，并且恒通空气0.006vvm（1.5mL/min）。然后将氧气的通气级联控制DO。其他参数控制见表1。
利用表1工艺条件控制，在长达144h的培养周期（图2）后，结果显示R1和R2最终活细胞密度（Viable cell density，VCD）均达到了1.20×107 cells/mL，且活率（Viability）维持在95%以上（图3）。实验过程中pH离线检测最低值保持在6.20以上，同时其他参数都在D²MS Pro（数据和设备管理系统）控制下稳定。而且离线检测的pCO2都在37mmHg以内，对细胞生长影响较小，与文献中的结果一致[6]（图3、图4）。
图2 SF9细胞在R1（左）和R2（右）条件下培养周期参数控制趋势图：— “温度（℃）”；— ”pH”；— “DO”；— “转速（rpm）”；— “空气流速（mL/min）”；— “氧气流速（mL/min）”。
图3 SF9细胞在R1和R2条件下培养过程增殖曲线及活率变化曲线
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图4 SF9细胞在R1和R2条件下pH、氧分压（pO2）和二氧化碳分压（pCO2）变化曲线
在生长初期，谷氨酰胺（Glutamine）随着细胞增殖呈指数性消耗（图6），待细胞进入生长停滞期时停止消耗并有小幅度回升的趋势，这表示谷氨酰胺和葡萄糖(Glucose）一样在SF9细胞生长过程中占重要地位。另外，NH4+浓度和乳酸（Lactate）浓度都在细胞生长后期都处于较低值（图5、图6），减少了对细胞生长的影响。
图5 SF9细胞在R1和R2条件下葡萄糖消耗曲线和乳酸代谢曲线。
图6 SF9细胞在R1和R2条件下谷氨酰胺消耗曲线和NH4+浓度变化曲线
[1] 吴清胜, 李媛媛, 姚春萍. 信号肽对SARS-CoV-2 S1、RBD、RBD二聚体蛋白在Expisf9昆虫细胞中分泌表达的影响[J]. 中国生物制品学杂志, 2024, 37 (03): 280-286.
[2] 魏佳琪, 孙振, 薛秀, 孟子燕, 于馨, 刘洋, 张建龙, 姜琳琳, 张兴晓, 朱洪伟, 于佳玉. 应当引起关注的昆虫细胞中的弹状病毒污染[J]. 病毒学报, 2024, 40 (02): 432-437.
[3] Parry Rhys, de Malmanche Henry, Asgari Sassan. Persistent Spodoptera frugiperda rhabdovirus infection in Sf9 cells is not restricted by Wolbachia wMelPop-CLA and wAlbB strains and is targeted by the RNAi machinery[J]. Virology, 2021, 563: 82-87.
[4] Hailun Ma, Andrea Kennard, Nicholas Mattson, Arifa S Khan. Characterization of Sf9 cell clones with differential susceptibilities to Sf-rhabdovirus X+3.7 and Sf-rhabdovirus X- replication[J]. Virology, 2024, 594: 110038-110038.
[5] ÖZLEM AYTEKİN, SAİME İSMET GÜRHAN, KAYOKO OHURA, TERUKO IMAI, GAYE ÖNGEN. Production of recombinant human dipeptidyl peptidase IV from Sf9cells in microbial fermenters[J]. TURKISH JOURNAL OF BIOLOGY, 2016, 40 (1): 217-228.
[6] Vajrala, Sucheta Gowthami. Mechanism of CO2 inhibition in insect cell culture[D]. University of Iowa, 2010.
CloudReady™ 云平台平行生物反应器和D²MS Pro（数据和设备管理系统）软件组成的高通量小规模研发平台，可进行DoE实验设计、自动化参数控制及多变量结果分析，支持复杂的数据采集分析和处理。支持主流通信协议，可与UPLC、自动取样分析仪、拉曼光谱仪等PAT设备互联互通，实现工艺开发的数据化和智能化。
