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生物反应器应用丨应用一次性生物反应器高密度培养大肠杆菌
来源:https://mp.weixin.qq.com/s/gcOdmh6Z_FKuajmQM4Py3Q | 作者:T&J | 发布时间: 2023-07-21 | 438 次浏览 | 分享到:
大肠杆菌是重组蛋白(RPs)最有效的表达宿主之一。具有表达系统清晰、培养成本低、操作简单、生长速度快等优势。被广泛应用于生物制药领域。

高细胞密度发酵是指在一定的培养体系内,利用改变培养方式或培养条件的方法,提高菌体生物培养密度,进而增加目标产物产量。

大肠杆菌 

高密度发酵


大肠杆菌是重组蛋白(RPs)最有效的表达宿主之一。具有表达系统清晰、培养成本低、操作简单、生长速度快等优势。被广泛应用于生物制药领域。


高细胞密度发酵是指在一定的培养体系内,利用改变培养方式或培养条件的方法,提高菌体生物培养密度,进而增加目标产物产量。

影响因素主要有:


① 培养基成分

② 菌种接种量

③ 培养温度

④ 发酵液pH

⑤ 溶氧

⑥ 补料策略

⑦ 诱导方式

⑧ 生长抑制物的积累                                                                                                                                              E. coli




01

实验使用的设备

Bioreactor

本实验采用迪必尔生物的一次性生物反应器(3L)系统,包含了最大体积为3L的一次性硬质发酵罐体和T&J-Intelli-Ferm A系列控制器(图1)。

                                                   图1 T&J-Intelli-Ferm A 台式生物反应器


该系统符合cGMP药品生产规范。具有易于安装的特点,且兼容玻璃罐体配件,可快速转移研发管线(图2),提高工艺开发效率,让研究者只需关注工艺开发。

                                                                                                     图2 一次性罐体结构

02

实验过程

Process

为了验证该款一次性生物反应器能否满足高细胞密度发酵,我们用大肠杆菌(BL21)在一次性生物反应器(3L)上进行了两次测试。


两次测试工作体积均为1.5L,接种量为工作体积的2%,并在发酵运行9h左右开始补料,24h结束培养,最终OD600分别达到84、79,验证了一次性生物反应器(3L)能为大肠杆菌提供适宜的生长环境,满足大肠杆菌的高密度发酵培养。


发酵过程中的溶氧变化可以反应菌株的生长情况。从接种开始,溶氧随发酵进行逐渐降低,当溶氧低于设定值30%时触发溶氧关联,搅拌、通气逐渐上升,直至溶氧值突然激增,此时发酵液内营养物质消耗殆尽,开启补料关联控制。此后在理想状态下溶氧会在设定值附近波动(图2)若溶氧波动较大则需要调整补料策略,如更改补料速度、补料关联模式。

                                                                                      图2 两次实验温度、溶氧、pH变化曲线


03

实验结论

Conclusion


OD600可以反应菌种的密度。若OD600上升变缓或开始下降,则表明菌株已进入生长末期,可以结束批次培养。


经过24h的发酵培养,第一次实验菌株OD600从摇瓶2.56增加至84,第二次实验菌株OD600从摇瓶1.62增加至79,均有较高的增殖(表1)

                                                                               表1 两次实验各阶段OD600数值


本次实验使用基础培养基,未添加微量元素、生物素等。两批菌株经过24h的培养,在装液量1.5L、接种量2%的条件下,都有较好的生长。在同等工艺条件下,迪必尔一次性生物反应器(3L)能达到玻璃生物反应器同等水平。


实验说明大肠杆菌在迪必尔一次性生物反应器(图3)能有较好的生长,实验中一次性生物反应器系统的温度、pH控制较为平稳,溶氧波动较小,能为菌株提供良好的生长环境。


                                 图3 迪必尔一次性生物反应器(3L)系统

实验使用的T&J-Intelli-Ferm A系列控制器,罐体从3L到15L可选,软件界面整合了多种补料策略及DO级联方式,是理想的缩小及放大应用发酵罐,适于所有的微生物培养,可轻松做到高密度发酵培养。