大肠杆菌
高密度发酵
大肠杆菌是重组蛋白(RPs)最有效的表达宿主之一。具有表达系统清晰、培养成本低、操作简单、生长速度快等优势。被广泛应用于生物制药领域。
高细胞密度发酵是指在一定的培养体系内，利用改变培养方式或培养条件的方法，提高菌体生物培养密度，进而增加目标产物产量。
影响因素主要有：
① 培养基成分
② 菌种接种量
③ 培养温度
④ 发酵液pH
⑤ 溶氧
⑥ 补料策略
⑦ 诱导方式
⑧ 生长抑制物的积累 E. coli
本实验采用迪必尔生物的一次性生物反应器（3L）系统，包含了最大体积为3L的一次性硬质发酵罐体和T&J-Intelli-Ferm A系列控制器（图1）。
图1 T&J-Intelli-Ferm A 台式生物反应器
该系统符合cGMP药品生产规范。具有易于安装的特点，且兼容玻璃罐体配件，可快速转移研发管线（图2），提高工艺开发效率，让研究者只需关注工艺开发。
图2 一次性罐体结构
为了验证该款一次性生物反应器能否满足高细胞密度发酵，我们用大肠杆菌（BL21）在一次性生物反应器（3L）上进行了两次测试。
两次测试工作体积均为1.5L，接种量为工作体积的2%，并在发酵运行9h左右开始补料，24h结束培养，最终OD600分别达到84、79，验证了一次性生物反应器（3L）能为大肠杆菌提供适宜的生长环境，满足大肠杆菌的高密度发酵培养。
发酵过程中的溶氧变化可以反应菌株的生长情况。从接种开始，溶氧随发酵进行逐渐降低，当溶氧低于设定值30%时触发溶氧关联，搅拌、通气逐渐上升，直至溶氧值突然激增，此时发酵液内营养物质消耗殆尽，开启补料关联控制。此后在理想状态下溶氧会在设定值附近波动（图2），若溶氧波动较大则需要调整补料策略，如更改补料速度、补料关联模式。
图2 两次实验温度、溶氧、pH变化曲线
OD600可以反应菌种的密度。若OD600上升变缓或开始下降，则表明菌株已进入生长末期，可以结束批次培养。
经过24h的发酵培养，第一次实验菌株OD600从摇瓶2.56增加至84，第二次实验菌株OD600从摇瓶1.62增加至79，均有较高的增殖（表1）。
表1 两次实验各阶段OD600数值
本次实验使用基础培养基，未添加微量元素、生物素等。两批菌株经过24h的培养，在装液量1.5L、接种量2%的条件下，都有较好的生长。在同等工艺条件下，迪必尔一次性生物反应器（3L）能达到玻璃生物反应器同等水平。
实验说明大肠杆菌在迪必尔一次性生物反应器（图3）能有较好的生长，实验中一次性生物反应器系统的温度、pH控制较为平稳，溶氧波动较小，能为菌株提供良好的生长环境。
图3 迪必尔一次性生物反应器（3L）系统
实验使用的T&J-Intelli-Ferm A系列控制器，罐体从3L到15L可选，软件界面整合了多种补料策略及DO级联方式，是理想的缩小及放大应用发酵罐，适于所有的微生物培养，可轻松做到高密度发酵培养。
