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用T&J-Atype发酵罐生物法发酵生产二硫键稳定的人源性抗bFGF双链抗体
来源:邓宁教授课题组 暨南大学广东省抗体药物与免疫检测工程技术研究中心 | 作者: 张思敏 | 发布时间: 2018-04-16 | 1067 次浏览 | 分享到:
毕赤酵母表达系统是近年来发展迅速的一个真核表达系统,对于异源表达有许多优点:①其分子遗传操作简单;②AOX I启动子具有很强的诱导启动特性,适合多种外源基因的高效表达;③重组毕赤酵母从摇瓶水平发酵扩大到细胞高密度发酵非常容易,外源基因的表达水平因此得到很大的提高,利于工业化生产;④外源蛋白的积累不会毒害酵母细胞;⑤毕赤酵母自身分泌蛋白少,简便纯化工艺;⑥外源基因重组在染色体实现一起复制和同步遗传,外源基因不易丢失。

基于以上,毕赤酵母得以在高密度发酵发挥其巨大潜力。

张思敏
邓宁教授课题组 暨南大学广东省抗体药物与免疫检测工程技术研究中心

(迪必尔生物编辑部 上海 0180401)
第一部分 前言

1 毕赤酵母表达系统

1.1毕赤酵母表达系统概述

毕赤酵母表达系统是近年发展迅速的一个真核表达系统,对于异源表达有许多优点①其分子遗传操作简单;AOX I启动子具有很强的诱导启动特性,适合多种外源基因的高效表达;重组毕赤酵母从摇瓶水平发酵扩大到细胞高密度发酵非常容易外源基因的表达水平因此得到很大的提高,利于工业生产;外源蛋白的积累不会毒害酵母细胞毕赤酵母自身分泌蛋白少,简便纯化工艺外源基因重组在染色体实现一起复制和同步遗传,外源基因不易丢失。

基于以上,毕赤酵母得以在高密度发酵发挥其巨大潜力。

 

1.2 常用表达菌株及表达载体

1.2.1表达菌株

目前,用于外源基因表达的P.pastoris菌株为Invitrogen公司构建,主要有:Y-11430M-G100-3GS115KM71SMD1168其中Y-11430为野生型,其余皆为组氨酸突变型GS115有完整的AOX Ⅰ基因,在甲醇培养基上表型为Mut+,当用重组表达载体转化后,因为表达载体线化所用酶不同,其转化子表型可能是Mut+或者Muts,可通过MDMM培养基进行表型的鉴定;KM71AOX Ⅰ基因被ARG4替代,虽然AOX ⅠAOX Ⅱ97%同源性,但AOX Ⅱ利用甲醇的能力远比AOX Ⅰ弱,在甲醇培养基上表现为Muts,其转化子也是Muts,表型不必鉴定。SMD1168为蛋白酶缺陷型菌株,特别适用于分泌表达载体,可避免表达外源蛋白被宿主菌同时表达的蛋白酶所降解

1.2.2 表达载体

P.pastoris没有稳定的附加体质粒,所以一般用整合型载体作为外源基因的表达载体。P.pastoris既有分泌表达型的,又有胞内表达型的,常用的表达载体主要:pPIC9pPIC9KpHILSpAO815pHIL-D2pPICz等,其中pPIC9KpHIL-S为分泌型表达载体,而pAO815pHIL-D2pPICz为胞内型表达载体多数P .pastoris表达载体还含有HIS4基因,它可以作为转化体的选择标记,同时还含有在细菌中复制所必须的序列及一些选择标记,如大肠埃希氏菌的复制起始点和Amp抗性基因等;还有一些载体含有来自于AOX Ⅰ基因的3’端侧翼序列,可以用来指导含外源基因的组件插入3’AOX Ⅰ基因位点或者以基因整合的方式整合到酵母染色体的AOX Ⅰ位点。一般情况下,整合到酵母染色体上的基因拷贝数越多,蛋白表达量就越高。多拷贝发生在AOX Ⅰ或者组氨酸基因位点,但同一位点同时插入多个基因的几率仅占His+转化体的1%-10%为此人们根据不同表达载体的组成特点,如pPIC3KpPIC9K含有kanr抗性基因;pPICz系列含有bler基因,利用基因剂量效应,分别依靠G418R或者ZeocinR的抗性水平来快速筛选除高拷贝的整合转化子。对于PAO815,一般通过多拷贝表达盒BamHI-BglII串联而先在体外用人工方法构建好多拷贝载体,然后转化到宿主菌中获得多拷贝转化子

 

1.3 影响外源蛋白表达的因素

1)启动子

在转录水平调控基因的表达常用的启动子主要有PAOX IPAOX IIPDAS,其中PAOX I对外源蛋白的驱动强度最高。最近在毕赤酵母中克隆到一个组成型启动子PGAG,由于组成型启动子不需要使用甲醇来诱导异源蛋白质的表达,简化了发酵工艺,并且对于某些产物表达量更高,因此成为最有潜力替代PAOX I的启动子。

2)外源基因的理化特点

外源蛋白的表达和分泌同时也受其自身的理化特点所影响。蛋白质自身特点决定了蛋白质被加工修饰后的去向,很难使不分泌的蛋白实现分泌。因此外源蛋白的结构和组成都会影响毕赤酵母对外源蛋白的分泌以及细胞外蛋白酶的水解性质。可见,外源基因自身特点很大程度上决定了分泌型外源蛋白在毕赤酵母中产量的高低。

3)外源基因拷贝数

在毕赤酵母中外源基因的拷贝数也可以影响其表达水平。有研究指出高拷贝外源基因可以提高外源蛋白表达水平。但也有些研究者发现并不是任何外源蛋白都是表达水平随着外源基因的拷贝数增加而提高,原因是高水平表达有可能会限制阻断分泌途径。为了提高外源基因的表达水平可以尝试提高整合基因的拷贝数,而且目前提高外源基因拷贝数的方法发展得也越来越成熟。例如Invitrogen公司发展的pPIC9K质粒上带有G418的抗性基因,可以快速筛选高拷贝转化子。

4)蛋白质分泌

外源蛋白表达最关键的影响因素是基因序列。信号肽影响着蛋白的分泌表达水平,如果宿主菌株自身信号肽序列很难达到预期的效果,可以借助酿酒酵母α-交配因子的信号肽序列,如用于提高胰岛素等小分子肽的表达量。

5)重组转化子的筛选

在对转化子进行大量筛选过程中常常发现,即使产生了有高效表达外源蛋白的潜力菌株,却不能筛选出来。因此为了达到高水平表达外源蛋白的目的,找到便捷、有效地筛选优良重组菌株的方法尤为重要。摇瓶水平发酵实验是常用的转化子的筛选方法。由于摇瓶发酵中溶氧条件的限制,培养基的pH值无法得到很好的控制及不能调整碳源的流加速率等,外源蛋白的表达水平通常不能反映发酵罐水平发酵的情况。但是对每一个表达菌株都进行发酵罐实验,会带来巨大的工作量。现在发展了一种shaken ceramic membrane flaskSCM)摇瓶培养技术,这种摇瓶培养相对于普通的摇瓶培养更好地反映发酵的发酵罐外源蛋白的水平,比正常发酵提高2-8倍。

flask

6)发酵条件的影响

研究发现用发酵罐发酵,表达产物的产量比普通摇瓶发酵最大可提高100倍,可见发酵条件对外源蛋白表达水平影响极大,如培养基的组分,诱导时温度,诱导时pH,补料策略等。影响因素将在后面详述

 

1.4 毕赤酵母高密度发酵技术

1.4.1 毕赤酵母高密度发酵的一般工艺过程

控制生物反应器在合适的条件下,毕赤酵母细胞生长迅速并且能够达到较高的细胞密度(细胞湿重>400g/L)。参照 Invitrogen公司的毕赤酵母发酵指导手册,现在毕赤酵母较普遍采用的发酵过程一般分为三个阶段,即甘油批次发酵阶段(Glycerol batch phase),甘油流加阶段(Glycerol fed-batch phase)和甲醇流加诱导阶段(Methanol fed-batch phase)。

在甘油批次发酵阶段,通常在培养约16-24h后毕赤酵母耗尽发酵基础培养基中所含4%的甘油,通过对通气和搅拌转速的调节维持溶氧水平在30%以上,菌体湿重增加。

在甘油流加阶段,甘油批次发酵后期,菌体在将其耗尽时溶氧值会骤升至100%左右,这时开始补充流加50%w/v)的甘油,控制甘油流加速率,维持溶氧水平在30%左右,在此阶段细胞群的产生决定了外源蛋白的表达。适当调节补料时间的长短,可以提高蛋白质的产量。甘油流加完成时细胞湿重期望能达到150-300g/L。由于甘油水平过高会有毒害作用,所以甘油的最高水平控制在4%

在甲醇流加诱导阶段,停止流加甘油,待培养基中的甘油完全消耗殆尽后,以溶氧曲线出现峰值即溶氧水平骤升至100%为信号,开始甲醇的流加诱导AOX 启动子表达驱动外源基因表达。此阶段中,每小时增加一次甲醇补加速率,持续调节5~8h至溶氧稳定在20%左右,使菌体慢慢适应利用甲醇进行生长并表达目标外源蛋白。根据所表达的蛋白和菌株的不同,此阶段控制最终甲醇流加的速率和流加持续时间都会有所不同。

1.4.2影响毕赤酵母高密度发酵的因素

1.4.2.1 培养基

培养基是细胞进行高密度发酵的一个基本发酵条件,其组成对细胞的生长和外源基因诱导表达的影响最为直接。现在的培养基一般采用Invitrogen公司建议的如BMGY/BMMYBSM,其中BMGY/BMMY 和培养基中含有磷酸盐缓冲液,可以维持在一定pH范围内,适合pH敏感度较高的外源蛋白的分泌表达。无机盐培养基BSM较便宜,一般配合使用PTM1微量元素溶液用于发酵罐水平的发酵。利用BSM进行发酵,有的外源蛋白能高效表达,有的则表达量少,甚至有的外源蛋白在 BSM 培养下根本不表达。所以可以通过优化BSM来提高目的蛋白产量。由于PTM1微量元素溶液成分较为复杂,必须过滤除菌,在发酵液中易生成沉淀,对大规模发酵造成很大影响,有研究人员发现可以用酵母提取物或者麦芽汁来替代PTM1,即简化工艺又降低成本,适用于工业化生产。

1.4.2.2 诱导期培养 pH

培养基的初始pH值对发酵过程中菌体生长水平、污染杂菌及表达蛋白的降解都有很大影响。不同的重组工程菌,有不同的最适生长和诱导pH值。P.pastorispH3.0~7.0下均可正常生长,但当p H低于2.0时菌体便不能正常生长,甚至会阻碍生长,最适菌体生长的pH范围为4.8~5.5。发酵过程中需要根据目标蛋白进行相应调整,在甲醇诱导阶段采用的p H需要能保持目标蛋白活性。

发酵培养基的pHP.pastoris的细胞繁殖和外源蛋白合成的影响主要表现在下面几个问题上:当p H值不适合以至抑制细胞中某些酶在代谢过程中的活性时,对正常的细胞代谢通路造成阻碍;影响P.pastoris细胞膜的通透性,阻碍细胞吸收培养基的必需营养物进行生长和排出代谢物到细胞外部;影响P.pastoris细胞利用中间代谢产物;菌体的代谢过程往往会因pH值不同而发生改变,使目标蛋白的产量发生改变。

因此,虽然P.pastoris的生长pH范围较宽,但也必须根据表达的外源蛋白不同选择尽量合适的pH值,尤其是在诱导外源蛋白表达阶段。

1.4.2.3 诱导期培养温度

温度也是利用毕赤酵母系统表达外源蛋白中一个重要影响,温度从多个方面影响菌体的生长和发酵。温度对毕赤酵母诱导生产目标蛋白的活性、培养基的发酵特质(氧传递等)及合成途径等方面有很大影响。

升高温度,从酶的动力学而言可以加快生长代谢使发酵周期缩短。但温度一旦超过一定值又会使酶失活速度加快,而且菌体容易衰老,最终降低外源蛋白的表达量。有研究表明,低温诱导有利于表达外源蛋白,主要原因是:较低的诱导温度能降低发酵时的菌体死亡率,并能有效降低胞外蛋白酶的合成。也有研究指出,温度也可能影响重组外源蛋白肽链的正确折叠,由于以较低温度培养时毕赤酵母细胞的生长速率降低,蛋白质的合成也收到阻碍,使得毕赤酵母表达系统得到充足的时间完成翻译后加工修饰和外源蛋白肽链的正确折叠。因此,不论对改善菌体生长还是对提高蛋白的表达水平来说,选择最适的培养温度都是相当重要的。


1.4.2.4 溶氧控制

高密度发酵过程中,用发酵罐进行培养,外源蛋白表达量比摇瓶发酵可提高近百倍,主要原因是利用普通摇瓶进行发酵的通气量太小,溶解氧水平低,培养基中氧气传递速率慢,因此对重组菌的高密度生长及外源蛋白表达有较为大的影响。

毕赤酵母具有好氧偏爱性,利用毕赤酵母进行高密度发酵需要消耗大量的氧气,而且供氧在甲醇诱导阶段是一个重要的限制性因子。如果没有足够的氧气供给,不仅抑制细胞呼吸,限制细胞增殖,而且会积累如甲醇,甲醛和过氧化氢的毒性代谢物,从而减少靶蛋白的表达水平。因此,必须供氧充足,一般控制溶氧在30%以上,但是溶氧也不能太高,溶氧>60%,氧气会对毕赤酵母细胞产生毒害。在毕赤酵母高密度发酵诱导阶段后期保持一个合适的溶氧水平,是提高发酵产量的重要因素。

为了解决发酵后期出现溶氧不足的情况,可以提高搅拌转速和通气量来增加溶氧,但是发酵过程中的能量损耗也随之增加;必要时采用纯氧与空气混合通气或富氧通气,甚至通入纯氧来提高发酵体系中的溶氧水平,但要避免局部氧中毒;也可以在发酵体系出现溶氧限制时,加入氧载体(oxygen-vectors),可提高发酵体系中的溶氧传递系数,解除溶氧不足的限制,提高发酵生产能力;通过重组菌基因组中整合可增加细胞摄氧率的蛋白基因,提高氧气利用率。

1.4.2.5 毕赤酵母高密度发酵过程控制

使用生物反应器发酵过程中最常见的参数控制包括发酵罐的温度和压力控制、发酵液的溶解氧和 pH 控制、代谢呼吸商的控制等。近年来,生物传感器技术和一些发酵液中物质的在线检测技术得到进一步发展,如诱导前菌体密度与比生长速率等调控的研究。

毕赤酵母的培养通常采用两步法,两个阶段中分别以甘油为菌体生长的碳源和以甲醇为诱导 AOX 启动子启动并以此驱动外源基因表达的碳源。由于甘油和 甲醇的浓度太高都会抑制毕赤酵母细胞的正常生长和目的外源蛋白的表达,所以需要通过优化寻找到最合适的甘油和甲醇的流加策略,以期达到显著提高外源蛋白产量的目的。

甘油的流加阶段是毕赤酵母高密度发酵过程中获得高细胞浓度的关键步骤,对下一阶段甲醇诱导表达外源蛋白有重要影响。甘油流加速度极为重要,较慢的流加速度让菌体生长缓慢,延长发酵时间,不能快速实现高密度。而过快的流加速度致使的甘油过量,不但容易使得菌体甘油中毒,更会造成甘油停止流加后向甲醇诱导的过渡时期延长,进而影响整个发酵过程的控制。因此控制一个适合甘油流加速度,即可发挥出毕赤酵母快速达到高密发酵的优势,又可以避免由于流加时间过长而引起的细胞衰老问题。

甘油补料策略一般采用甘油恒速流加或者指数流加的方式,恒速流加相对于指数流加方式,在消耗甘油的过程中,菌体的比生长速率会由于发酵液中甘油残余浓度的下降而降低,其优点是可以较稳定地过渡到下一阶段的甲醇诱导期;而甘油指数流加的方式,使得菌体的比生长速率恒定,从而得到更多的菌体量。

甲醇的流加阶段是毕赤酵母高密度发酵过程诱导目的蛋白表达的关键步骤。其流加方式有多种,各有优势。

1)溶氧恒定流加策略:是指在甲醇诱导期间通过溶氧补料联动来控制甲醇的补料速率。在甲醇诱导阶段,固定转速和通气量,将溶氧设定在一个固定的范围,当溶氧值高于所设定值的上限时就自动流加甲醇,当溶氧低于设定值的下限时,就自动停止流加甲醇。而这一溶氧值的范围设定,需要根据不同的发酵情况来看。例如有研究者在低温诱导发酵时控制较高的溶氧(30-50%)可有效提高外源蛋白的表达;而有研究者在单独甲醇补料时发现降低的溶氧(15-25%)更利于重组毕赤酵母表达外源蛋白。

2)恒定甲醇流速补料策略:即在甘油耗尽后,逐步提高甲醇的补料量直到到达一个稳定值,一般是根据溶氧来确定这一补料速率。以这种方式进行补料时,需要注意控制甲醇的速率在一个适合的范围,既不能过高,也不能太低。过高,则会引起细胞甲醇中毒,升至会导致细胞死亡;过低,细胞则会因为营养不足而不能正常生长,进而影响外源蛋白的表达。

3)混合碳源补料策略:目前报道的混和碳源补料的方式有两种,一种是将另一种碳源和甲醇按适当的比例混合后一起流加到培养基中;另一种则是以恒定的速率补加甲醇,来调节另一种碳源的补加速率。常用的与甲醇混合的碳源有甘油和山梨醇。

4)恒定比生长速率补料策略:即在甲醇流加时,控制流加速率以维持稳定的菌体比生长速率。

5)通过在线检测甲醇的含量进行补料:即通过甲醇在线监测手段控制发酵液中甲醇含量在一个适合的范围,以避免甲醇过量积累对菌体的毒害作用。目前常用的甲醇检测手段有:用气相色谱进行检测,此种方法测得结果的准确性很高,但只能用于离线检测,不能及时反映发酵液中实时甲醇浓度;用甲醇传感器在线检测,此种方法可在线检测发酵液中的甲醇浓度,并在配套软件的作用下可及时对甲醇的补加速率进行调节;用顺序注射分析和流动注射分析系统检测,这两种系统是在甲醇传感器的基础上建立的检测方法,比单独使用甲醇传感器时,检测结果更准确。

6)基于已有的生长模型进行补料:即根据大量实验和经验建立的数学模型,再根据这一模型进行甲醇流加。

7)将底物比消耗速率与产物比生成速率相结合进行补料:即将发酵过程中底物比消耗速率,能量代谢及产物比生成速率结合起来建立最佳的补料策略,这种方法充分考虑了发酵过程中各种条件的动态变化,对甲醇补料的调节更加精确。在研究过程中,根据诱导外源蛋白表达所用的补料碳源不同,常采用的诱导期补料方式分为单一甲醇补料和甲醇混合补料两种方式。

 

2 血管新生与肿瘤的发生

肿瘤细胞需要血管运输营养物质和氧,同时血管将代谢废物和二氧化碳排出。如果没有血管,肿瘤生长不能超过特定的临界值大小或转移至另一个器官。因此,通过阻断肿瘤血管生成能作为癌症预防和治疗的一个有效策略。

肿瘤血管形成的机制非常复杂,目前研究最多的就是一系列促血管新生因子参与其中,如碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)。这些因子由肿瘤细胞自身产生或由侵润在肿瘤组织中的炎症细胞(如巨噬细胞)分泌。并且多种肿瘤组织,如肺腺癌、肝癌、黑色素瘤、脑胶质瘤、横纹肌肉瘤等,高表达bFGFVEGF及其受体。因此,国内外研制以VEGFbFGF为靶点的抗血管新生药物被认为是临床治疗肿瘤的有效方法,比传统的化疗药物更具有安全性,且无明显细胞毒副作用,不会产生广谱耐药性。

目前,抑制肿瘤血管新生的抗体药物Avastin(抗VEGF抗体药物)在临床上广泛用于恶性结直肠癌、非小细胞肺癌、恶性肾细胞癌、乳腺癌和脑癌的治疗。但该抗体药物长期使用会代偿性的促进bFGF和血小板源性生长因子(PDGF)表达,进而促进肿瘤血管新生,促进肿瘤复发和生长,导致耐药。所以,抗bFGF 抗体有可能解决以VEGF为靶点的抗血管新生治疗所产生的代偿性耐药性等问题。 

bFGF也称FGF-2,属于一个包含至少22个肝素结合生长因子的FGF大家族。bFGF在多种恶性肿瘤中均有表达, bFGF与受体结合诱导的信号转导在肿瘤血管形成和肿瘤细胞的增殖迁移过程中起着重要作用,与肿瘤的发生发展有密切关系。bFGF主要通过硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)结合到细胞膜表面的高亲和力受体FGFRs(即酪氨酸激酶受体),使FGFRs发生自身磷酸化及二聚化,与具有Src原癌基因家族同源区(SH2)的蛋白结合,分别激活不同的信号转导途。bFGF / FGFR诱导的信号转导途径主要包括:PKC路径、Ras/Raf/MEK/ERK路径、JAK/STAT途径和PI3K/Akt途径。从信号传导的角度分析bFGF作用于肿瘤的机制,通常Ras/Raf-MEK/MAPK/c-myc信号途径参与调控肿瘤细胞生长增殖,PI3K/Akt途径参与肿瘤细胞的迁移及侵袭。

 

3 小分子抗体

随着基因工程技术的发展、抗体基因结构的逐步阐明以及DNA重组技术应用于抗体结构的改造,使抗体由细胞工程抗体(即单克隆抗体)发展到基因工程抗体。其中基因工程小分子抗体,以单链抗体ScFv为主,其分子量只有完整抗体IgG1/6-1/2,且具有结构简单、分子量小、穿透性强、生产成本低廉等优点,其不足是只能单价结合靶向抗原,亲和力低且半衰期短。大量的研究证明二硫键稳定的双链抗体(ds-Diabody)能够显著地提高抗体的稳定性,二硫键将两条肽链共价地连接在一起同时还保持着甚至还能提高抗原结合活性,从而使抗体表现出更强的抗肿瘤活性,或将拓展其在肿瘤诊治方面的应用。

 

4 研究的目的及意义

T&J-Atype 10L发酵罐实现抗bFGF的二硫键稳定的人源性双链抗体在毕赤酵母表达体系中的高密度发酵,提高目的蛋白的表达水平。

 

第二部分 材料和方

1 实验材料

1.1 菌株

表达ds-Diabody的毕赤酵母GS115菌株为本实验室前期构建和保存;

1.2 主要试剂及耗材

试剂名称

公司

货号

Unstained Protein Molecular Weight Marker

Thermo

#26610

Prestained Protein Ladder

Thermo

#26616

BCA试剂盒

Thermo

#23227

人源性抗bFGF全长抗体human antibody

由实验室前期制备

/

1.3 主要试剂的配制

1) 10×甘油90 mL去离子水中加入10 mL甘油,于锥形瓶中充分搅拌混匀后高压蒸汽灭菌,置于4 ℃冰箱中保存。

2) 10×甲醇 95 mL去离子水中加入5 mL甲醇,充分搅拌混匀后,过滤除菌,置于4 ℃冰箱中保存。

3) 1M磷酸盐缓冲液(pH 6.0): 分别称量30.12 g K2HPO4118.14 g KH2PO4置于1 L的烧杯中加入约800 mL的去离子水,搅拌溶解,再加入去离子水定容液体至1 L,混匀后调整pH6.0(用KOHH3PO4调节),通过高压蒸汽灭菌后,置于4 ℃冰箱中保存。 

4) 10×YNB(不含氨基酸的酵母氮源): 分别称取34 g YNB不含氨基酸也不含硫酸铵100 g硫酸铵置于1 L烧杯中,加入约700 mL去离子水,充分搅拌溶解后加入去离子水定容液体至1 L,过滤除菌置于4 ℃冰箱中保存。YNB不太好溶解,可以适当地加热,但温度不宜过高,一般不超过50

5) 500×生物素称取20 mg 生物素置于500 mL的烧杯中,加入约90 mL去离子水,搅拌过夜使其充分溶解(因生物素较难溶于水然后加入去离子水定容液体至100 mL,搅拌混匀后过滤除菌置于4 ℃冰箱中保存。

6) 10×葡萄糖20 g的葡萄糖溶于100 mL去离子水中,充分搅拌混匀后,高压蒸灭菌,置于4 ℃冰箱中保存。  

7) YPD分别称取1 g Yeast Extract2 g Trypton置于300 mL的锥形瓶中,加入90 mL去离子水充分搅拌溶解若是配固体培养基则再加入2 g琼脂,高压蒸汽灭菌,待培养基冷却至室温,再加入10 ml 10×葡萄糖混合均后置于4 冰箱中保存备用。

8) 酵母生长培养基(BMGY: 分别称取1 g Yeast Extract 2 g Trypton置于200 mL的锥形瓶中,加入70 mL去离子水搅拌溶解后,高压蒸汽灭菌,待培养基冷却至室温后加入下列成分并混匀:10×甘油 10 mL10×YNB 10 mL1 M的磷酸盐缓冲液(pH 6.010 mL500×生物素 0.2 mL混匀后置于4 ℃冰箱中保存。

9) 酵母诱导培养基(BMMY: 分别称取1 g Yeast Extract 2 g Trypton置于200 mL的锥形瓶中,加入70 mL去离子水搅拌溶解后,高压蒸汽灭菌,待培养基冷却至室温后加入下列成分并混匀:10×甲醇 10 mL10×YNB 10 mL1 M的磷酸盐缓冲液(pH 6.010 mL500×生物素0.2 mL混匀后置于4 ℃冰箱中保存。 

10) 0.015M PBS缓冲液pH 7.4):分别称量2.9 g Na2HPO4•12H2O0.2 g KH2PO4•2H2O8.0 g NaCl0.2 g KCl溶于1 L的去离子水中充分搅拌混匀后置于4 ℃冰箱中保存。

11) 洗涤液(PBS-T):含0.05 %(v/v) Tween-200.015 MPBS缓冲液pH 7.4),即1 L PBS中加入0.5 mlTween-20,充分搅拌混匀后置于室温中保存 

12) 发酵基础盐培养基:

Phosphoric acid, 85% 26.7 ml
Calcium sulfate 0.93 g
Potassium sulfate 18.2 g
Magnesium sulfate-7H2O 14.9 g
Potassium hydroxide 4.13 g
Glycerol 40.0 g
加水至1升,直接加入发酵罐内灭菌。

13) PTM1微量元素溶液:

Cupric sulfate-5H2O 6.0 g
Sodium iodide 0.08 g
Manganese sulfate-H2O 3.0 g
Sodium molybdate-2H2O 0.2 g
Boric Acid 0.02 g
Cobalt chloride 0.5 g
Zinc chloride 20.0 g
Ferrous sulfate-7H2O 65.0 g
Biotin 0.2 g
Sulfuric Acid 5.0 ml
加无菌水至1L,抽滤除菌,室温保存。

14) 补料生长培养基:

向每升已灭菌的50%甘油加入12 ml已抽滤除菌的PTM1微量元素溶液。

15) 发酵诱导培养基:

向每升甲醇加入12 ml 已抽滤除菌的PTM1微量元素溶液。

16) 30%丙稀酰胺:分别称取29 g丙烯酰胺和1 g甲叉丙烯酰胺,溶于100 ml去离子水,充分搅拌溶解后用滤纸过滤,置于4 ℃冰箱中避光保存。

17) 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8):称量181.7 g Tris置于1000 mL烧杯中,加入约700 ml的去离子水,置于磁力搅拌器上充分搅拌溶解,然后入适量的去离子水定容溶液终体积1000 mL最后用盐酸调节溶液pH值至8.8,置于室温保存备用。 

18) 1.0 M Tris-HCl (pH 6.8):称量121.1 g Tris置于1000 mL烧杯中,加入约700 ml的去离子水,置于磁力搅拌器上充分搅拌溶解,然后入适量的去离子水定容溶液终体积1000 mL,搅拌均匀后盐酸调节溶液pH值至 6.8,置于室温保存备用  

19) 10% SDS:称量100 g SDS置于1000 mL的烧杯中,加入900 mL去离子水将溶液适当加热使SDS充分溶解,然后再加入适量的去离子水定容溶液终体积至1000 mL,搅拌均匀后调节溶液pH值为7.2,置于室温保存备用  

20) 10%过硫酸铵:称量10 g过硫酸铵置于200 mL的烧杯中,加入90 mL的去离子水搅拌溶解然后再加入适量的去离子水定容溶液终体积至100 mL,混匀后分装成1 mL/支,置于-20 ℃冰箱中保存备用 

21) 12%分离胶(15 mL):分别量取4.9 mL去离子水,6.0 mL 30%丙稀酰胺,3.8 mL 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)0.15 mL 10%SDS, 0.15 mL 10%过硫酸铵,0.006 mL TEMED,充分混合均匀后加入制胶板中。

22) 5%浓缩胶(6 mL):分别量取4.2 mL去离子水,1.0 mL 30%丙稀酰胺,0.75 mL 1.0 M Tris-HCl (pH 6.8)0.06 mL 10%SDS0.06 mL 10%过硫酸铵,0.006 mL TEMED,充分混合均匀后加入制胶板中。

23) 5×Tris-Glycine电泳缓冲液:分别称取15.1 g Tris-base94 g Glycine5 g SDS置于1000 mL烧杯中,加入约800 mL去离子水充分搅拌使其溶解,最后再加入适量的去离子水定容溶液终体积1000 mL

24) 加样缓冲液(loading buffer):分别量取下列试剂,置于15 mL离心管中2.5 mLTris-HCl1 M , pH 6.8),1.0 g SDS50 mg 溴酚蓝,5.0 mL甘油,然后加入去离子水搅拌溶解后定容溶液终体积10 mL混匀后分装成十小份(1 mL/份),于室温保存。使用前将50 μlβ-巯基乙醇加到每小份中。

25) 考马斯亮蓝染色液:分别量取100 mL冰醋酸,250 mL异丙醇,称量2.5 g考马斯亮蓝R-250置于1000 mL烧杯中,加入约500 mL的去离子搅拌溶解后再加入去离子水定容溶液终体积至1 L,充分搅拌混匀后置于室温保存

26) 凝胶脱色液:分别量取100 mL冰醋酸,500 mL甲醇置于1000 mL的量筒中,加去离子水定容液体1000 mL,充分搅拌混匀后置于室温保存

27) Western blot转膜缓冲液:分别称取2.9 g Glycine5.8 g Tris-base0.37 g SDS置于1000 L烧杯中加入约600 mL的去离子水搅拌溶解后,再加入200 mL甲醇,最后去离子水定容液体终体积1000 L,充分搅拌混匀后置于室温保存

1.4 主要仪器设备

仪器名称

公司

T&J-AType 10L发酵罐                                                    

高压灭菌锅

迪必尔生物工程上海)有限公司

广州医疗设备厂

pH值检测仪

Mettler Toledo

小型台式恒温震荡器

上海福玛实验设备有限公司

高速冷冻离心机

Heraeus Biofug primo R

磁力搅拌器

上海雷磁仪器厂

凝胶电泳仪

Bio-rad

凝胶成像系统

Bio-rad

多功能微孔板检测仪

BioTek

光学显微镜

Olympus CKX41

超净工作台

苏州净化设备仪器厂

 

T&J-AType 10L发酵罐

2
 实验方法

1菌种准备:YPD平板挑重组人源性抗bFGF二硫键稳定的双链抗体酵母工程菌GS115/Ds-diabody单菌落接种于种子培养基中(BMGY),28180rpm培养18hr后以1100比例转接到300ml培养基中(BMGY),28180rpm振荡培养36hr

2校正溶氧电极:发酵罐中装入发酵基础培养基,安装好发酵罐。断开溶氧电极电源,DO值降至接近0%时,定0点。接通溶氧电极电源,DO值上升至不再升高为止,定为100%。

3校正 PH 检测计:用标准PH溶液校对PH检测计。

4灭菌: 发酵基础培养基装入发酵罐中, 将发酵罐安装好后置高压锅中灭菌, 121℃灭菌20min

5 接菌:向每升培养基中加入4.35ml PTM1微量元素溶液,用氨水调PH5.0。按10%接种量将种子液接入发酵基础培养基中(10L发酵罐内)。

6 发酵:发酵最低转速200rpm,最高转速900rpm28℃恒温发酵。当溶氧(Dissolved oxygen, DO)陡然上升时,18.15ml/h/L流加补料生长培养基,约4h。当菌体湿重达到180-220g/L时,停止甘油补料,维持30min。待甘油耗尽后调节pH6.0,而后流加发酵诱导培养基,刚开始2-3h流速为3.6ml/h/L,后流速调整为7.2 ml/h/L,维持1-2h,最终流速调整为10.8ml/h/L。通过调节转速、通气量和甲醇流加速率使溶氧大于20%。发酵液的甲醇浓度控制在10g/L。发酵时长约100hr左右。

 

第三部分 结果与分析

如图1所示,将种子菌液接入发酵罐后,菌体在一定时间处于缓增殖状态。此时溶氧和转速联动,溶氧维持在20%以上,转速从最低转速不断上升。在发酵20-22hr,溶氧陡然上升(红色箭头所示),预示发酵基本培养基中的碳源已经耗竭,开始补加补料培养基。当菌体湿重达到200g/L停止补料,4h。此时转速下降,溶氧先陡然上升(蓝色箭头所示),随后维持在20%左右。等甘油耗尽后补加诱导培养基以启动 PAOX I 表达目的蛋白。

                                       1

     

如图2所示,在表达外源蛋白阶段,同样通过控制诱导培养基的流加速率来控制溶氧在 20%左右。在诱导过程中刚开始2-3h流速为3.6ml/h/L,后流速调整为7.2 ml/h/L,维持1-2h,最终流速调整为10.8ml/h/L。通过调节转速、通气量和甲醇流加速率使溶氧大于20,隔一段时间做DO spike防止甲醇过量,发酵时长100h左右

    

图2 

 

图3所示为菌体生长曲线及诱导过程目的蛋白的表达情况。在发酵26h,菌体利用完甘油,此前菌体湿重刚开始缓慢上升,随后呈现出指数增长。发酵26h后,流加甲醇开始诱导,菌体湿重刚开始减少,随后在整个诱导过程都缓慢增长,在发酵的35h开始,即诱导的第9h,开始有目的蛋白表达,目的蛋白的表达在发酵的135h,即诱导的第105h达到最高表达量,随后开始降解。通过高密度发酵,目的蛋白表达量相比摇瓶提高10倍以上。

 

图3 

4  通过T&J-Atype 10L发酵罐高密度发酵,目的蛋白表达量相比摇瓶提高10倍以上

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注:本文内容由张思敏老师提供,由迪必尔生物小编整理发布

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